李 建，廖園園，朱 微，曹 娟，秦 偉，漆世華，謝紅玲，楊 雷

(武漢中博生物股份有限公司，武漢430070)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種高度接觸性傳染病，又稱“藍(lán)耳病”[1]。該病以懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及仔豬呼吸困難、高死亡率和育肥豬呼吸異常為特征，也稱“豬不孕與流產(chǎn)綜合征”[2]。1992年，歐盟將該病統(tǒng)一命名為“豬繁殖與呼吸綜合征”[3]。世界衛(wèi)生組織(OIE)將該病列入法定通報傳染病，我國列為二類動物疫病。

單克隆抗體以其高度均質(zhì)性、高度特異性、來源穩(wěn)定等特點，可直接用于疾病的臨床診斷，尤其是疑似病例的病毒抗原檢測[4]，也可作為原材料廣泛應(yīng)用于多種診斷方法。本文旨在篩選生物活性好、抗體分泌穩(wěn)定的抗PRRSV的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為PRRSV的臨床快速診斷商品化試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞、實驗動物和其他試劑 骨髓瘤細(xì)胞、PRRSV、猴腎細(xì)胞(Marc-145)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)均為武漢中博生物股份有限公司保存;8周左右的雌性BALB/c購自武漢生物制品研究所;DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)、次黃嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶與次黃嘌呤胸腺嘧啶(HT，Sigma公司)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Thermo公司)、異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記抗鼠 IgG(Thermo公司)、單抗亞類鑒定試劑盒(洛陽賽爾維公司)。

1.2 病毒增殖與純化 在Marc-145細(xì)胞傳代后接種PRRSV，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變(CPE)后收毒，收獲后的病毒經(jīng)超濾濃縮，差速離心，蔗糖密度梯度離心[5]，電鏡檢測。

1.3 免疫 用純化的PRRSV與等量的弗氏完全佐劑充分乳化后，采用皮下多點免疫雌性BALB/c小鼠，分別間隔三周用減半劑量加弗氏不完全佐劑進(jìn)行二免和三免，融合前三天腹腔加強注射。

1.4 間接ELISA篩選方法的建立 采用間接ELISA方法，按方陣法[6]確定包被PRRSV純化抗原濃度、抗體的最適工作濃度。以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，測定OD450nm值。以陽性血清OD值在1.0左右，同時與陰性血清OD值差距最大的抗原包被濃度、抗體稀釋度為最佳工作濃度。

1.5 雜交瘤細(xì)胞株的建立 按常規(guī)方法[7]將免疫的小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇進(jìn)行融合，然后置HAT選擇性培養(yǎng)基，將其加入到鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，間接ELISA和間接免疫熒光方法進(jìn)行篩選，有限稀釋法連續(xù)稀釋三次，陽性孔單克隆雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代3個月。

1.6 腹水的生產(chǎn)及其純化 選12周齡左右的雌性BALB/c，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行腹水的生產(chǎn)，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水。

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 單克隆抗體的效價 采用已經(jīng)建立的間接ELISA法測定細(xì)胞上清和腹水中單克隆抗體的效價。

1.7.2 單克隆抗體的亞類 用抗原依賴分型法間接ELISA測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體的亞類。

1.7.3 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 按常規(guī)方法[8]對雜交瘤細(xì)胞的染色體進(jìn)行分析，于高倍顯微鏡下觀察，每份樣本應(yīng)計數(shù)100個中期完整的核細(xì)胞，記錄染色體數(shù)目的分布。

1.7.4 單克隆抗體的特異性鑒定

1.7.4.1 交叉反應(yīng) 以PPV、PRV、PCV2為包被抗原，用腹水分別與其進(jìn)行交叉檢測，用間接ELISA檢測OD450nm值。

1.7.4.2 間接免疫熒光法(IFA) 用PRRSV接種于含Marc-15細(xì)胞的96孔板中，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)72 h后用-20℃丙酮固定。按方陣法[9]確定的腹水、FITC標(biāo)記的抗鼠IgG的工作濃度和反應(yīng)時間進(jìn)行IFA檢測，于熒光顯微鏡下觀察。

1.7.4.3 免疫過氧化物酶單層實驗(IPMA) 細(xì)胞板的制備和固定方法與制備IFA細(xì)胞板方法相同。按方陣法[9]確定腹水，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG最佳工作濃度和反應(yīng)時間進(jìn)行IPMA檢測，經(jīng)3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)進(jìn)行底物顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核之后，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.7.4.4 疊加實驗 參照文獻(xiàn)方法[10-11]進(jìn)行疊加ELISA實驗，并按其公式計算相加指數(shù)(AI)。

1.7.4.5 相對親和力的測定 方法參見文獻(xiàn)[12]。

1.7.4.6 單克隆抗體的穩(wěn)定性檢測 獲得的2個細(xì)胞株經(jīng)穩(wěn)定傳代后凍于液氮，1個月后復(fù)蘇，檢測細(xì)胞上清抗體。再經(jīng)腹腔注射BALB/c小鼠，同樣檢測腹水的抗體效價，并與凍存前效價進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒的增殖與純化 經(jīng)密度梯度離心之后總計獲得2.5 mg的PRRSV病毒，首次免疫劑量為每只50 ug/0.5 mL，電鏡結(jié)果見圖1。

圖1 PRRSV電鏡圖片(箭頭所指為PRRSV病毒粒子)

2.2 間接ELISA法工作條件的選擇 根據(jù)方陣法確定間接ELISA方法最佳的PRRSV包被濃度為1 ug/mL。經(jīng)間接ELISA法篩選，3次亞克隆共獲得2株分泌抗PRRSV的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3D10和4H11。

2.3 單克隆抗體的鑒定

2.3.1 單克隆抗體的效價測定 3D10雜交瘤細(xì)胞上清的ELISA效價在1∶1024，腹水的ELISA抗體效價在1∶107，IFA效價1∶80;4D11雜交瘤上清的ELISA效價在1∶512，腹水的ELISA抗體效價在1∶106，IFA 效價 1∶40。

2.3.2 單克隆抗的的亞類測定 3D10亞類為IgG1，4H11 亞類為 IgG2b。

2.3.3 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 雜交瘤細(xì)胞的染色體在90～110范圍內(nèi)變化，平均值在98左右，該數(shù)值大于脾細(xì)胞染色體數(shù)的2倍，小于脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目之和，表明該雜交瘤細(xì)胞確實為脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的產(chǎn)物。

2.3.4 單克隆抗體的特異性鑒定

2.3.4.1 交叉反應(yīng) 間接ELISA檢測結(jié)果表明:PPV、PRV、PCV2均不與PRRSV腹水發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3.4.2 IFA試驗 腹水1∶1000稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠IgG1∶100稀釋，5株單克隆抗體均能與Marc-145細(xì)胞中的PRRSV發(fā)生反應(yīng)，可見接種了PRRSV的Marc-145的細(xì)胞膜或胞漿中出現(xiàn)了綠色熒光(圖2)，陰性對照未見熒光。

圖2 PRRSV單抗免疫熒光圖片(400×)

2.3.4.3 IPMA試驗 腹水1∶1000稀釋，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG1∶100稀釋，AEC顯色，2株單克隆抗體均能與Marc-145細(xì)胞中的PRRSV發(fā)生反應(yīng)，可見接種了PRRSV的Marc-145細(xì)胞膜或胞漿中出現(xiàn)紅色著染(圖3)，陰性對照細(xì)胞未見陽性反應(yīng)。

2.4 疊加實驗 2株單抗疊加指數(shù)為72.91%，大于50%，說明2株單抗識別不同的抗原位點。

2.5 親和力實驗 經(jīng)非競爭ELISA方法測定3D10的親和常數(shù)6.5×109L/mol，4H11的親和常數(shù)4.0 ×109L/mol。

2.6 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性鑒定 2株雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定傳代后凍于液氮，1個月后復(fù)蘇，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，抗體分泌水平與凍存前相同。腹腔接種BALB/c小鼠后可致瘤，并穩(wěn)定地分泌特異性抗體。

3 討論

在單克隆抗體制備的實驗設(shè)計中，確定陽性克隆篩選方法至關(guān)重要。間接ELISA方法具有特異性強，靈敏度高，操作簡單等優(yōu)點，而且可以同時檢測大批量樣品，平行性、穩(wěn)定性也比較好，已廣泛應(yīng)用于單克隆抗體的篩選與鑒定。本實驗用全病毒作為檢測抗原的ELISA方法篩選陽性細(xì)胞克隆，考慮到免疫原不純的問題，篩選時采用了交叉篩選的方法。從結(jié)果來看，2株單克隆抗體均不與豬其他常見的病毒如PPV、PRV、PCV2發(fā)生交叉反應(yīng)。本研究通過對細(xì)胞的克隆化這一關(guān)鍵步驟的把握，使得所制備的單克隆抗體具有陽性克隆多，穩(wěn)定性好的特點:首先在細(xì)胞生長至孔底1/2～1/3時進(jìn)行克隆，避免了陽性細(xì)胞的漏檢和染色體丟失情況的發(fā)生;采用操作簡單的有限稀釋法，保證了獲得的雜交瘤穩(wěn)定，抗體分泌效價高;經(jīng)過3次克隆化獲得的雜交瘤陽性率達(dá)100%，間接ELISA證明上清效價1∶100，OD 值在1.0 左右，腹水效價 1∶107。

目前，國外應(yīng)用14株分別針對PRRSV N蛋白、M蛋白、GP3和GP5不同表位的單抗研究了PRRSV的中和表位和ADE表位[13]，發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)中和抗體的表位存在于M蛋白、GP3蛋白和GP5蛋白，而誘導(dǎo)ADE表位主要是N蛋白。本試驗研制出的2株單抗已經(jīng)證實識別不同抗原表位，但具體識別哪種蛋白表位還需進(jìn)一步驗證。下一步，將應(yīng)用本研究制備的2株P(guān)RRSV單克隆抗體建立免疫酶和免疫熒光方法，作為PRRSV臨床快速診斷方法的補充和驗證。

[1]黃佳佳.豬繁殖與呼吸綜合癥的防治[J].中國畜牧雜志，2006，42(24):60-62.

[2]Andreyev V G，Wesley R D，Mengeling W L，et al.Genetic variation and phylogenetic relationships of 22 porcine porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)field strains based on sequence analysis of open reading frame 5[J].Arch Virol，1997，142:993-1001.

[3]Wensvoort G，Kluyver E P.Lelystad virus，the cause of porcin ecpidemic abortion and and respiratory syndrome:a review of mystery swine disease research at lelystad[J].Vet Microbiology，1992，33:185-193.

[4]郭寶清，陳章水，劉文清，等.從疑似 PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRS的研究[J]. 中國畜禽傳染病，1996，87(2):1-4.

[5]杜念興.獸醫(yī)免疫學(xué)[M].第二版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[6]焦新安，劉秀梵.實驗手冊.江蘇農(nóng)學(xué)院傳染病教研組，1990:39-50.

[7]劉秀梵.單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用[M].合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1994:32-36.

[8]章谷生，容秉培.單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987.

[9]曹雪濤.精編免疫學(xué)實驗指南[M].北京:科學(xué)出版社，2009.

[10]崔尚金，王云峰，王翠蘭，等.應(yīng)用單克隆抗體進(jìn)行兔輪狀病毒的抗原分析[J].中國獸醫(yī)科技，1997，27(5):24-25.

[11]劉 潔，何文輝，李晶梅，等.分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立[J].中國獸藥雜志，2013，47(7):9-12.

[12]Macdonald R A，Hosking C S，Jones C L.The measurement of relative antibody affinity by ELISA using thiocyanateelution[J].J Immuno Meth，1988，106:191.

[13]Dea S，Gagnon C A，Mardassi H，et al.Antigenic variability among North American and Eurpean strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as defined by monoclonal antibodies to the matrix protein[J].J Clin Microlo，1996，34(6):1488-1493.