滕曉萍，王宏昊，花圣卓，劉 洋，關(guān) 銘

（1.高原圣果沙棘制品有限公司，北京 100036；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL·）是胡頹子科（E1aeagnaceae）沙棘屬的灌木或小喬木。別名醋柳、黑刺、酸刺、沙棗、其察日嘎納（蒙名）、達(dá)普（藏名）、吉汗（維吾爾名）。沙棘是蒙古族和藏族常用中藥材，具有較高的藥用價(jià)值。依據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，沙棘具有利肺、升陽(yáng)、健脾、養(yǎng)胃、活血化瘀、消炎生肌等藥理功效［1］。沙棘中含有齊墩果酸和熊果酸成分。齊墩果酸具有護(hù)肝降酶、降低血脂、抗炎利尿、抗腫瘤等作用［2］。熊果酸具有顯著的抗致癌、抗促癌和免疫作用［3］，具有降低血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化及由其引起的心腦血管病作用［4］。

目前，使用HPLC法同時(shí)測(cè)定中藥中齊墩果酸和熊果酸含量的報(bào)道較多［5-15］，但對(duì)沙棘葉及枝條中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定至今尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為開(kāi)發(fā)沙棘葉新的藥用資源，本研究建立了同時(shí)測(cè)定沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC法，為分析、評(píng)價(jià)沙棘及其相關(guān)制品以及有關(guān)質(zhì)量控制，提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20ATVP高效液相色譜儀及LC-solution工作站（日本島津公司）；AB-E 分析天平（METTLER TOLEDO）；紫外掃描儀（日本島津UVmini-1240）；超聲清洗器（KQ 3200DE 昆山市超聲儀器有限公司）。

齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所批號(hào)：110709-200505）；熊果酸對(duì)照品（四川維克奇生物科技有限公司）；甲醇（色譜純 天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；娃哈哈純凈水；乙醇（分析純 北京化工廠）。

2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack型C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液（87∶13）；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫30℃；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL。對(duì)照品及樣品分析的HPLC 圖譜見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

3 溶液制備

3.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品1.4mg，熊果酸對(duì)照品1.5mg，分別置于10mL 容量瓶中。加入乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品溶液濃度均分別為0.14mg/mL 和0.15mg/mL。

3.2 供試品溶液的配制

稱取沙棘葉25.0g，適當(dāng)粉碎。以300mL95%乙醇回流提取2 次，第1 次回流2.0h，第2 次回流1.5h，回流溫度為95℃。提取液經(jīng)濃縮、烘干、真空干燥后得沙棘葉提取物粉末。精密稱取上述沙棘葉提取物粉末44.8mg，置于10.0mL 容量瓶，加8.0mL 乙醇，超聲提取20min，加入乙醇定溶至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

4 結(jié)果

4.1 線性關(guān)系考察

取上述對(duì)照品溶液，分別以5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL進(jìn)樣分析。以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，齊墩果酸和熊果酸的回歸方程分別為：Y=410182x+13635，r=0.9994；Y=400000X+17667，r=0.9993，結(jié)果表明齊墩果酸和熊果酸在0.7～2.1μg和0.75～2.25μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)定峰面積值，計(jì)算出齊墩果酸RSD%為1.33%，熊果酸的RSD%為2.63%。表明方法精密度良好。

4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取沙棘葉提取物粉末6 份，按“3”項(xiàng)下方法制備溶液并進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)峰面積值，計(jì)算齊墩果酸的RSD%為2.39%，熊果酸的RSD%為1.54%，方法重現(xiàn)性良好。

4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品按“3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2”項(xiàng)下色譜條件在0h、2h、4h、8h、12h 測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算其含量。結(jié)果為供試品溶液中齊墩果酸和熊果酸的RSD%分別為1.33%和2.63%，表明供試品溶液在12h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，可滿足測(cè)定需要。

4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知齊墩果酸和熊果酸含量的沙棘葉提取物粉末6份，分別加入齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品混合溶液適量，配制加標(biāo)樣品溶液。進(jìn)樣測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的含量，計(jì)算回收率。齊墩果酸和熊果酸的平均加樣回收率分別為99.88%（RSD=2.95%）和100.80%（RSD=2.81%）。

4.6 含量測(cè)定

取沙棘葉適量，按供試品制備方法處理，按照上述HPLC條件測(cè)定，采用外標(biāo)法測(cè)定沙棘葉中齊墩果酸含量為0.081%，熊果酸含量為0.221%，即三萜酸總含量為0.302%。

為全面考察三萜酸在沙棘各部位的分布情況，使用上述條件和方法，也測(cè)定沙棘枝條和沙棘果實(shí)中三萜酸成分含量，結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1 三萜酸在沙棘中的含量分布

5 討論

（1）沙棘是一種藥食同源植物，在我國(guó)分布廣泛，資源豐富，其應(yīng)用前景可觀。但沙棘葉的利用率較低，截至目前為止，尚未見(jiàn)有關(guān)沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量測(cè)定的報(bào)道。本研究首次建立了同時(shí)測(cè)定沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC方法。結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。

（2）HPLC 法測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的含量，采用紫外檢測(cè)器時(shí)，需要選擇適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)。由于二者的最大吸收波長(zhǎng)均在202nm左右，若檢測(cè)波長(zhǎng)小，溶劑系統(tǒng)（甲醇-水）的截止波長(zhǎng)（205nm）接近檢測(cè)波長(zhǎng)，則造成基線噪音大，基線平衡困難；若檢測(cè)波長(zhǎng)大，則二者的吸收值太低，響應(yīng)因子小，靈敏度降低，同樣影響組分的檢測(cè)。因此，本研究結(jié)果證明，采用HPLC法測(cè)定齊墩果酸和熊果酸含量時(shí)，以選擇210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)較適宜。

（3）齊墩果酸和熊果酸互為三萜類同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)十分相似，分離困難較大。經(jīng)比較甲醇-水、甲醇-磷酸、甲醇-冰醋酸和乙腈-水體系后，選擇甲醇-0.2%磷酸體系作為流動(dòng)相，分離效果較好。

采用本文建立的方法同時(shí)測(cè)定沙棘葉中兩者的含量，操作簡(jiǎn)便、手段先進(jìn)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

在科研上，目前基本只注重對(duì)于沙棘黃酮的研究，已有大量關(guān)于沙棘黃酮的先進(jìn)提取、分離方法的文獻(xiàn)報(bào)道，而針對(duì)其他活性成分的報(bào)道甚少。

目前，沙棘中三萜酸和生物堿類成分的深入研究和開(kāi)發(fā)利用尚屬空白，對(duì)沙棘的果實(shí)、莖、葉等各部位中三萜酸和生物堿類成分的提取分離、含量測(cè)定以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面研究尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究是高原圣果沙棘制品有限公司和吉林大學(xué)共同的研究課題，著重研究我國(guó)資源豐富、易于收集且易于儲(chǔ)存的沙棘葉為研究對(duì)象，對(duì)其中的三萜酸和生物堿類活性成分的提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期為沙棘中三萜酸和生物堿類成分的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)沙棘藥品和沙棘保健品提供參考依據(jù)。

[1]周張章,周才瓊.沙棘的化學(xué)成分及保健作用研究進(jìn)展[J].糧食與食品工業(yè),2005，12（2）：15-18.

[2]馬瑜紅.沙棘的有效成分及藥理研究進(jìn)展[J].四川生理科學(xué)雜志,2005,27（2）：75-77.

[2]LIAO Qing-Gui（廖清貴）.Development of oleanolic acid of natural drug（齊墩果酸天然藥物的開(kāi)發(fā)）[J].Sci Technol Forest Sichuan（四川林業(yè)科技），1999,20（4）：68.

[3]孟艷秋,陳瑜,王趲,等.熊果酸的研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2007,16（1）：25-28.

[4]宋京,張慶林.熊果酸藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,1999,30（增刊）：95 -96.

[5]顧學(xué)芳,田澍,黃丹.苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的提取及含量測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2008,29（5）：96-98.

[6]廖瓊峰,李繼,吳筱妹,等.反相高效液相色譜法測(cè)定陸英中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].藥物分析雜志,2005,25（7）：781-783.

[7]白雪梅,付煜榮,田嘉銘.高效液相色譜法測(cè)定大山楂丸和山楂鮮果中齊墩果酸及熊果酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2006,26（8）：981-982.

[8]王志芳,汪芳安,彭光華,等.木瓜中齊墩果酸和熊果酸提取工藝的研究[J].食品科技,2006,7：134-137.

[9]黃宏偉.不同花色映山紅花中熊果酸和齊墩果酸的含量比較[J].生命科學(xué)儀器,2008,6（12）：17-19.

[10]李坤平,潘天玲,賁永光,等.超聲波強(qiáng)化溶劑提取姜味草中熊果酸和齊墩果酸[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2009,29（3）：111-114.

[11]鄒盛勤,陳武.反相高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地紫蘇子和白蘇子中烏索酸和齊墩果酸[J].生物加工過(guò)程,2008,6（4）：65-68.

[12]陳世斌,徐社金,江小蓉,等.高效液相色譜法測(cè)定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].Pharmacy Today,2009,19（2）：46-47.

[13]蔡中齊,馬鴻雁,張勉.不同產(chǎn)地及外觀形態(tài)夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量比較[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2009,25（3）：256-258.

[14]相廷英,楊光.常用中藥中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2004,24（5）：316-318.

[15]羅曉清,?，|,錢蘇生.RP-HPLC法測(cè)定石楠葉中熊果酸和齊墩果酸的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2003,17（5）：14-15.