朱海燕，聶 波，徐 冰，劉 蓓，吳圣賢，陳立新

四妙勇安湯是用于治療下肢動(dòng)脈閉塞癥和脈管炎的傳統(tǒng)名方，由于其活血祛瘀、通絡(luò)止痛的作用與冠心病心絞痛的病因病機(jī)相吻合，故在臨床亦觀察到其可改善冠心病心絞痛患者的臨床癥狀［1］。本課題組前期研究已證實(shí)，四妙勇安湯對(duì)治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者臨床癥狀具有較滿(mǎn)意的療效。但因原方中藥量過(guò)大，給新藥開(kāi)發(fā)帶來(lái)難度。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)易損斑塊穩(wěn)定性起重要作用的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)NF-κB活化和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）分泌的測(cè)定，探索四妙勇安湯的有效組分，為藥物的下一步研發(fā)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞系（RAW264.7細(xì)胞），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，96孔白色底透培養(yǎng)板（Costa）。

1.2 試劑及耗材 640培養(yǎng)基，小牛血清，LPS（Sigma），MMP-9 ELISA試劑盒（Jiamay Biotech Co），水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本），Safire2高速多通道連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（TECAN，奧地利），Bright-Glo Luciferase熒光素酶檢測(cè)試劑（Promega），48孔和96孔培養(yǎng)板（Costar）。

1.3 樣品制備 “四妙勇安湯”提取物共8個(gè)。方法：原料藥材55%乙醇提取2次，1.5h／次，得到55%乙醇提取液和殘?jiān)?5%乙醇提取液濃縮至干，水混懸，上大孔樹(shù)脂，連續(xù)依次采用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇淋洗，分別獲得水部位、30%乙醇部位、60%乙醇部位、95%乙醇部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品2號(hào)～5號(hào)；殘?jiān)盟?次，1.5h／次，得到水提液，留取部分水提液濃縮至干得到樣品1，其余用水混懸，上大孔樹(shù)脂，連續(xù)依次采用水、55%乙醇、95%乙醇淋洗，分別獲得水部位、55%乙醇部位、95%乙醇部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品6號(hào)～8號(hào)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、造模方法和抑制率的檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞在37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)于含10%小牛血清1640培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，以10×104／well的密度接種于48孔培養(yǎng)板中。模型制備前，換以等體積無(wú)血清1640培養(yǎng)基，待篩樣品與細(xì)胞預(yù)先孵育1h。模型制備時(shí)，每孔加入終濃度為5μg／mL LPS，與細(xì)胞共同作用24h，收集細(xì)胞上清，之后每孔加入50μL Bright-Glo Luciferase熒光素酶檢測(cè)試劑，室溫避光震蕩5min，置于多功能酶標(biāo)儀中，設(shè)定光化學(xué)檢測(cè)程序進(jìn)行檢測(cè)。該模型以熒光素酶光化學(xué)值的變化直接指示樣品對(duì)NF-κB-RE是否有阻斷作用。因此，通過(guò)計(jì)算抑制率，可確定樣品在NF-κB信號(hào)通路中對(duì)早期基因表達(dá)阻斷作用的強(qiáng)弱。

以ELISA法檢測(cè)MMP-9含量。根據(jù)ELISA說(shuō)明書(shū)逐步操作，最后在酶標(biāo)儀450nm處讀出OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D 450值為縱坐標(biāo)，繪制濃度OD450標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出待測(cè)樣品作用后的濃度，并通過(guò)與模型組比較，觀察樣品對(duì)MMP-9的抑制作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞上清液中MMP-9的含量測(cè)定 在正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞上清中，MMP-9含量較低；LPS作用24h后，MMP-9含量顯著增高。初篩結(jié)果顯示，1、2、3、4、6、7、8號(hào)提取物能夠降低細(xì)胞上清MMP-9含量，提示可能具有降低RAW264.7細(xì)胞中MMP-9產(chǎn)生及分泌的作用，故對(duì)上述7種提取物進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果顯示，1、2、4號(hào)提取物在5μg／mL～100μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴(lài)關(guān)系；3、6號(hào)提取物在5μg／mL～50μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴(lài)關(guān)系；7、8號(hào)提取物在5μg／mL～25μg／mL范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴(lài)關(guān)系。（注：7、8號(hào)提取物在50μg／mL時(shí)即出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用，故復(fù)篩時(shí)二者濃度均未高于50μg／mL）。

表1 提取物對(duì)LPS致巨噬細(xì)胞損傷模型上清MMP-9含量的影響（x±s，n=3）

2.2 提取物對(duì)NF-κB反應(yīng)原件結(jié)合抑制劑篩選模型的作用1、2、3、4、6、7號(hào)提取物對(duì) NF-κB信號(hào)通路具有阻斷作用，能夠通過(guò)抑制早期基因表達(dá)而抑制該病理信號(hào)通路。（注：8號(hào)提取物在100μg／mL和50μg／mL時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用，故計(jì)算濃度未高于50μg／mL）。詳見(jiàn)表2。

表2 提取物對(duì)NF-κB反應(yīng)原件結(jié)合抑制劑篩選模型的作用（x±s，n=3）

3 討 論

隨著“動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)”學(xué)說(shuō)的公認(rèn)，清熱解毒中藥已成為治療冠心病的常用中藥［2］。四妙勇安湯配伍精當(dāng)，藥專(zhuān)力宏，是最具中醫(yī)配伍和用量特色的藥物之一，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、生甘草組成，具有抑菌、消炎、促進(jìn)血液循環(huán)等作用，常用于治療氣滯血瘀、靜脈阻塞而發(fā)的脈管炎、血栓閉塞性脈管炎［3］。而冠心病心絞痛的基本病機(jī)是氣虛血瘀，病理機(jī)制為絡(luò)脈癖阻細(xì)急而痛［4］，與四妙勇安湯方證相吻合。四妙勇安湯可改善冠心病心絞痛患者的臨床癥狀［1］。本課題組前期研究也證實(shí)，對(duì)冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者臨床癥狀具有較滿(mǎn)意的療效。

本實(shí)驗(yàn)采用巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞作為研究材料，并通過(guò)LPS刺激活化巨噬細(xì)胞。在眾多的炎細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞對(duì)斑塊穩(wěn)定性的作用尤為重要?；罨木奘杉?xì)胞除了是形成動(dòng)脈粥樣硬化病變的主要組成部分，還可在炎癥因子的刺激下分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，降解斑塊中的膠原和細(xì)胞外基質(zhì)成分，使纖維帽變薄，易于形成不穩(wěn)定性斑塊。其中，最主要的是MMP-9，它對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡起重要作用，其在冠狀動(dòng)脈動(dòng)脈壁和外周血中的增加程度與病變嚴(yán)重程度正相關(guān)［5］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：四妙勇安湯的1、2、4號(hào)提取物在5μg／mL～100 μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞后MMP-9的分泌，具有濃度依賴(lài)關(guān)系；3、6號(hào)提取物在5μg／mL～50μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴(lài)關(guān)系；7、8號(hào)提取物在5 μg／mL～25μg／mL范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后 MMP-9的分泌，具有濃度依賴(lài)關(guān)系。結(jié)果提示四妙勇安湯的部分提取物可抑制巨噬細(xì)胞分泌MMP-9，因此可能具有減少斑塊基質(zhì)降解，穩(wěn)定斑塊的作用。

MMP-9主要在轉(zhuǎn)錄水平受NF-κB、AP-1等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)［6］，目前許多學(xué)者認(rèn)為NF-κB的激活是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)機(jī)制之一［7］。本研究選擇不穩(wěn)定型心絞痛易損斑塊炎癥反應(yīng)的核心病理環(huán)節(jié)——NF-κB，對(duì)四妙勇安湯全部連續(xù)組分進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)四妙勇安湯抑制NF-κB信號(hào)通路的有效部位分別為位1、2、3、4、6、7。其中有效部位2、3、4的IC50值較低，表明抑制效果最好。

綜合MMP-9和NF-κB被抑制的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯有效部位1、2、3、4、6的作用較為安全可靠。此外，在篩選出中藥有效部位的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化中藥配伍和配比關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)抗不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定易損斑塊有效中藥具有重要意義。

［1］ 許恒忠，李金英，蘇子德.四妙永安湯加味治療冠心病心絞痛的療效觀察［J］.邯鄲醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2005，18（1）：45-46.

［2］ 吳同和.清熱解毒法對(duì)不穩(wěn)定性心絞痛患者C反應(yīng)蛋白的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2006，26（11）：43-44.

［3］ 賴(lài)天松.中西醫(yī)匯通常用方劑［M］.廣州：廣東科技出版社，1999：117.

［4］ 吳以嶺.從絡(luò)病學(xué)說(shuō)論治冠心病心絞痛［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7（4）：71.

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［6］ Luttun A，Lutgens E，Manderveld A，et al.Loss of matrix metalloproteinase-9or matrix metalloproteinase-12protects apolipoprotein E-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth［J］.Circulation，2004，109（11）：1408-1414.

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