天津醫(yī)科大學(xué)第一中心臨床學(xué)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點實驗室（天津300192） 郭瑞雪 沈中陽 宋紅麗 杜杰靜 張 靜 鄭衛(wèi)萍 王玉亮

肝移植是治療終末期肝病的主要手段之一，但是移植后排斥反應(yīng)嚴(yán)重影響了療效和預(yù)后。這種排斥反應(yīng)主要與T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答相關(guān)。MSCs低表達主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ（MHC-Ⅰ）類分子，不表達MHC-Ⅱ類分子和 B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD40或CD40L等共刺激分子，這些特性使得其具有低免疫原性，能夠?qū)е耇細胞無能，從而抑制免疫排斥或誘導(dǎo)免疫耐受，降低移植排斥發(fā)生率［1］。本實驗旨在建立體外共培養(yǎng)體系研究BM MSCs對淋巴細胞增殖的抑制機制，現(xiàn)分析報告如下。

材料與方法

1 材料與試劑

1.1 實驗動物：Wista大鼠，雄性，體重100～120g，SPF級，4～5周齡，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.2 主要試劑：DMEM／F12培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），Percoll淋巴細胞分離液（Amersham Bioscience公司，美國），胎牛血清（PAA公司，奧地利），胰蛋白酶（Sigma公司，美國），ELISA盒（R＆D System，美國），正常大鼠BRL細胞（中科院上海細胞生化所），抗大鼠的 CD45-PE、CD90-FITC、CD34-FITC、CD29-PE、RT1A-PE、RT1B-FITC、IgG-FITC和IgG-PE（Biolegend公司，美國），抗大鼠的 CD4-FITC、CD25-PE、Foxp3-PE-Cy5（eBioscience公司，美國）。

2 實驗方法

2.1 大鼠MSCs的分離和培養(yǎng)：全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)MSCs。具體方法：用5%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠致死，75%乙醇浸泡3min，無菌條件下取其脛骨股骨。剪去其兩端骨骺，于10cm2培養(yǎng)皿內(nèi)使用含15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制成單細胞懸液。置于含15%FBS、100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。37℃，5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48h后換液。此后每2～3d換液1次，細胞生長至80%左右融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代MSCs細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105／ml備用。

2.2 流式檢測大鼠MSCs的表型鑒定：收集生長良好的第3代 MSCs，消化、計數(shù)，使細胞濃度為1×106／L，分別加入1.25μl的抗體 CD45、CD29、RT1A，0.5μl的抗體CD90、RT1B，20μl的抗體CD34，同時用IgG作為陰性對照，共孵育30min后，用PBS洗滌，經(jīng)流式細胞儀檢測。

2.3 大鼠脾臟淋巴細胞的制備：用5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠致死，無菌條件下取出脾臟，用200目尼龍網(wǎng)研磨后，應(yīng)用淋巴細胞分離液獲得淋巴細胞，DMEM低糖培養(yǎng)基洗滌2次。調(diào)整細胞濃度為1×106／ml備用。

2.4 BRL的制備：將BRL細胞加入10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)，最后調(diào)整細胞濃度2×105／ml備用。

2.5 MSCs細胞與淋巴細胞共培養(yǎng)：將淋巴細胞、MSCs、BRL和ConA分別分組接種于6孔培養(yǎng)板，每組3個副孔，每孔總量4ml。

2.6 實驗分組：①淋巴細胞組；②淋巴細胞+ConA組；③淋巴細胞+ConA+MSCs組；④淋巴細胞+ConA+MSCs+BRL組。37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)0h、24h和48h。

2.7 ELISA定量檢測各組培養(yǎng)上清中TNF-α、TGF-β1、IL-10的含量：待各組共培養(yǎng)0h、24h和48h后收集上清，方法按試劑說明書進行。

2.8 MTT法淋巴細胞混合反應(yīng)：將MSCs，淋巴細胞，BRL和ConA接種于96孔板，共培養(yǎng)0h、24h和48h后MTT法檢測淋巴細胞相對細胞數(shù)。

2.9 流式檢測Treg含量：取共培養(yǎng)上清液以2500rpm離心5min，棄去上清留下細胞沉淀，按照說明書進行流式檢測準(zhǔn)備工作。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究對所有數(shù)據(jù)采用SSPS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 骨髓MSCs的形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定

1.1 形態(tài)學(xué)觀察：見圖1。剛接種下的骨髓MSCs呈大小較均一的圓形，胞膜清晰，胞體透亮。6h后開始貼壁，48h已牢固貼壁，生長速度較慢，4～5d后可有偽足伸展，以后成為長梭形細胞，出現(xiàn)明顯集落，在10d左右可以呈現(xiàn)80%融合。消化傳代后細胞平均4～5d再次傳代，細胞形態(tài)較為均一。

1.2 表型鑒定：見圖2。CD90、CD29和RT1A陽性，CD45、CD34和RT1B陰性，說明我們所提取培養(yǎng)的細胞正是骨髓MSCs。

圖1 MSCs的體外培養(yǎng)（倒置相差×100）

2 ELISA法檢測各組培養(yǎng)上清中3種細胞因子分泌量 見表1。24h和48h的3、4組TGF-β1和IL-10較1、2組表現(xiàn)高分泌（P＜0.05），TNF-α表現(xiàn)低分泌（P＜0.05），0h基本沒有變化，TGF-β1分泌隨時間延長增高，但IL-10變化不明顯（P＞0.05）。

圖2 MSCs流式表型鑒定

表1 各組24h和48h的 TNF-α、TGF-β1 和IL-10分泌量（±s，ng／L）

表1 各組24h和48h的 TNF-α、TGF-β1 和IL-10分泌量（±s，ng／L）

注：1組為淋巴細胞；2組為淋巴細胞+ConA；3組為淋巴細胞+ConA+MSCs；4組為淋巴細胞+ConA+MSCs+BRL

TNF-α IL-10組 別TGF-β 0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h 1組 2.73±0.21 21.89±0.64 7.70±2.69 71.27±2.98 151.78±5.95 199.67±11.16 55.21±3.26 65.05±1.48 59.920±1.93 2組 2.76±0.16 79.71±4.74 3組 2.75±0.25 25.35±0.36 34.25±1.07 70.74±10.42 201.51±7.81 241.50±4.09 54.58±1.48 85.48±6.37 171.05±14.52 t（2：1） 0.19 6.63 12.96 -0.07 7.16 4.98 -0.25 4.42 5.47 t（3：1） 0.07 -4.46 5.49 -0.73 7.19 12.58 0.10 74.71 26.66 t（3：2） -0.10 -19.20 -14.11 -0.35 4.62 11.23 0.34 13.17 7.83 t（3：4） -0.35 29.95 13.10 -0.43 -5.60 -5.24 -0.27 -5.34 -6.16 t（4：2） 0.32 -31.41 -33.63 -0.05 21.47 10.53 1.03 13.97 8.46 P（2：1） 0.87 0.022 0.006 0.95 0.019 0.038 0.83 0.048 0.032 P（3：1） 0.95 0.047 0.032 0.54 0.019 0.006 0.93 0.000 0.001 P（3：2） 0.93 0.003 0.005 0.76 0.044 0.008 0.77 0.006 0.016 P（3：4） 0.76 0.001 0.006 0.71 0.030 0.035 0.82 0.033 0.025 P（4：2） 0.78 0.001 0.001 0.97 0.002 0.009 0.41 0.005 0.014 107.47±1.63 4組 2.83±0.26 19.76±0.20 18.98±1.10 67.74±6.18 294.92±27.54 387.01±17.86 55.56±3.75 144.86±0.30 3.34±0.75 8.80±0.07 70.33±5.73 413.06±11.54 556.20±42.05 56.35±1.93 160.57±4.15

3 MTT法檢測MSCs對淋巴細胞增殖作用結(jié)果見表2。24h和48h的3、4組OD值較1、2組降低（P＜0.05），0h基本沒有變化（P＞0.05）。

4 流式檢測Treg含量結(jié)果 見圖3。24h和48h的3、4組Treg含量均較1、2組增高（P＜0.05），并且48h含量較高于24h（P＜0.05）。

表2 各組24h和48h的OD值（±s）

表2 各組24h和48h的OD值（±s）

注：1組為淋巴細胞；2組為淋巴細胞+ConA；3組為淋巴細胞+ConA+MSCs；4組為淋巴細胞+ConA+MSCs+BRL

組 別 0h 24h 48h 1組 0.459±0.038 0.353±0.024 0.415±0.024 2組 0.480±0.020 0.563±0.025 0.557±0.021 3組 0.449±0.029 0.229±0.023 0.371±0.023 4組 0.485±0.019 0.104±0.013 0.226±0.032 t（2：1） -1.01411.980 9.023 t（3：1） -1.786-7.441-2.665 t（3：2） -0.421-19.578-11.995 t（3：4） -2.055 9.404 7.407 t（4：2） 1.460-32.208-17.373 P（2：1） 0.350 0.000 0.000 P（3：1） 0.124 0.000 0.037 P（3：2） 0.689 0.000 0.000 P（3：4） 0.086 0.000 0.000 P（4：2） 0.195 0.000 0.000

討 論

骨髓MSCs主要有賴于其免疫表型而被識別，我們對分離擴增后的骨髓MSCs的表面標(biāo)志進行了流式細胞儀檢測，結(jié)果表明骨髓MSCs高表達CD90、CD29和RT1A，不表達CD45、CD34和RT1B，與文獻報道一致［2］。許多研究已表明：MSCs可以抑制同種異體抗原對T細胞刺激的反應(yīng)，但具體機制尚不清楚。有研究認(rèn)為骨髓MSCs發(fā)揮作用是通過細胞-細胞接觸，但是更多則認(rèn)為是通過分泌可溶性因子實現(xiàn)的［3］。本實驗建立體外共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察MSCs對淋巴細胞的影響，檢測發(fā)現(xiàn)抑炎細胞因子TGF-β1和IL-10的含量在含有骨髓MSCs組均顯著增高，促炎細胞因子TNF-α含量降低，以及Treg含量增高，說明MSCs能夠促進負(fù)性免疫應(yīng)答。

圖3 Treg流式圖

TGF-β1是免疫系統(tǒng)中良好的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能夠誘導(dǎo)自身耐受和器官耐受，維持免疫平衡［4］。Bertolo等［5］將 MSCs與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達增加。Qian等［6］等的研究也證實了TGF-β1在MSCs對淋巴細胞的抑制作用中非常重要，我們的實驗結(jié)果與之一致，同時證明了這種作用隨時間延長幾乎沒有改變。

IL-10是另一重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，能夠抑制單核／巨噬細胞 MHC-Ⅱ類分子，間接降低T細胞增殖。Gao等［7］發(fā)現(xiàn)IL-10在MSCs發(fā)揮抑制作用中有著重要作用。這與我們的實驗結(jié)果一致，但是有部分學(xué)者認(rèn)為：在MSCs對淋巴細胞抑制過程中，IL-10的分泌量沒有增加，其具體機制有待證實。

TNF-α除致炎作用外，還能夠促進T細胞、胸腺細胞以及B細胞等的增殖和分化，參與某些免疫病理過程。方 翔［8］等經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs移植能夠降低肺氣腫大鼠血漿中TNF-α的含量。這與我們實驗結(jié)果相同，說明骨髓MSCs能夠通過降低TNF-α的分泌來減弱淋巴細胞的增殖和分化。

Treg是一類表面高表達IL-2受體α鏈（CD25）、胞質(zhì)中表達Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的CD4+T細胞，能夠抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖，達到負(fù)性調(diào)節(jié)以及自身免疫耐受的作用。Wang等［9，10］經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)：骨髓MSCs移植能夠顯著增加外周血和淋巴結(jié)中Treg的含量，抑制急性排斥反應(yīng)，延長受鼠的生存時間。我們的體外實驗得到了相同結(jié)果，這表明MSCs能夠通過提高Treg含量抑制淋巴細胞增殖。

肝臟作為“免疫特惠器官”表現(xiàn)一定程度的天然免疫耐受性，移植排斥反應(yīng)發(fā)生率和嚴(yán)重度較少較輕，但是這仍然是移植失敗的一個主要因素。我們在共培養(yǎng)體系中加入BRL，想由此來了解骨髓MSCs在大鼠正常肝細胞存在情況下是否仍然對淋巴細胞起到抑制作用。

總之，骨髓MSCs具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的能力，使其成為治療免疫系統(tǒng)紊亂引起的疾病的潛在方法，例如移植后排斥反應(yīng)。

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