西安交通大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科（西安710004）

張桂蓮 杜 赟 姚 麗 張 茹 劉璟潔 卜 寧 吳海琴 張 磊 郭英英 李婷婷

已有報道，阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）與嗅覺損害有關，嗅覺閾值與AD的程度有關［1，2］。單純毀損嗅球可降低大鼠學習記憶功能［3］。嗅覺損害可能在主要臨床癥狀出現(xiàn)前出現(xiàn)［4］。在AD的早期階段，嗅球即被涉及，大量的淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）斑和tau蛋白纖維纏結貫穿了嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)，這是對嗅覺早期損害的有力支持［2，5］。然而，也有研究認為，雖然在嗅覺中樞出現(xiàn)AD的特征性病理改變，而嗅覺的損害并沒有優(yōu)先［6］。我們早期的研究分別觀察了側腦室注射Aβ25-35后MAPK信號轉導通路家族的成員之一—磷酸化p38MAPK（p-p38）在海馬CA1區(qū)及嗅球的各自表達，為了進一步探討是否嗅球的損害先于海馬，我們擬對比觀察p-p38在大鼠嗅球與海馬CA1的表達，進一步探討不同腦區(qū)p38與AD臨床結果的關系。

材料和方法

1 材 料

1.1 實驗動物的篩選及分組：選擇健康成年雄性SD大鼠，體質量260±20g，根據(jù)實驗要求標準環(huán)境下喂養(yǎng)1周，每籠3～5只。大鼠在Y型迷宮內適應3min后，給予適當電擊，直至3臂均探索進入為止，選擇活躍、對電擊反應敏感、逃避反應迅速的72只大鼠供實驗用。將其隨機分為陰性對照組、癡呆組、抑制劑組和溶媒對照組，每組18只。再根據(jù)觀察時間點將每組大鼠分為4d、7d和14d三組，每組6只。

1.2 實驗試劑及其配制：β-淀粉樣蛋白多肽片段（Aβ25-35）、p-p38抗體（Thr180／Tyr182）、p38抑制劑—SB203580、二甲基亞砜（DMSO）分別由美國Sigma，Alexis Cell及Signaling公司提供。

SB203580溶液及Aβ25-35聚合態(tài)的制備：將Aβ25-35用無菌生理鹽水稀釋，配制成濃度為3nmol／μl的溶液，使用前將Aβ25-35溶液在37℃孵育4d即可成為聚合態(tài)的 Aβ25-35。用1%DMSO配制成濃度為0.1nmol／μl的SB203580溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方 法

2.1 動物模型的構建：術前12h給大鼠禁食，4h禁水。用1%戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔注射麻醉，等大鼠的翻正反射消失后，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上。選擇右側側腦室為注射靶區(qū)，于前囟向后0.8mm，中線旁開1.5mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，挑破硬腦膜。①癡呆組：用微量注射器垂直進針3.8mm，以1μL／min的速度緩慢注入 Aβ25-35溶液5μl，留針5min后緩慢拔針，縫合切口。②陰性對照組：用同樣方法將等量生理鹽水注入大鼠右側側腦室。③抑制劑組：同法將SB203580溶液5μl注入大鼠右側側腦室。30min后，將Aβ25-35溶液5μl注入。④溶媒對照組：用同樣方法將1%DMSO5μl注入大鼠右側側腦室，30min后，再將Aβ25-35溶液5μl注入。術后動物單籠飼養(yǎng)至清醒，并每日肌注青霉素鈉5萬單位，共3d以防感染。

2.2 動物行為學測試：四組大鼠于以上處理后4d、7d、14d行Y迷宮測試。記錄實驗中每只大鼠達到學會標準的訓練次數(shù)（Number，N），完成所有反應中錯誤反應的次數(shù)（Error number，EN），全天總反應時間（Total reaction time，TRT）。

2.3 免疫組化檢測：四組大鼠在行為學測試后快速灌注取腦，分離嗅球及海馬，分別常規(guī)進行石蠟包埋切片，層厚5μm。采用免疫組化SABC法檢測p-p38蛋白表達量，p-p38抗體的濃度為1∶50。

2.4 圖像采集及分析：選取每只大鼠的海馬及嗅球切片各1張，用圖像分析儀檢測每張切片海馬CA1區(qū)及內嗅小球層p-p38表達陽性細胞的灰度，每張切片隨機檢測5次，取其平均值（灰度值范圍為0～255，分別由黑色～白色表示）；灰度值越低，表示表達的陽性細胞數(shù)越多。

2.5 統(tǒng)計學方法：所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件建庫、處理。各指標用±s表示。兩組以上計量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，即F檢驗，其中兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。

結 果

1 行為學檢測 由表1可見，在AD大鼠建模4d時，各組大鼠的行為學指標基本正常；陰性對照組各時間點間比較，大鼠達到學習標準的N、EN和TRT無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。癡呆組在Aβ注射7d、14d后，N、EN和 TRT均明顯增加（P＜0.05）。抑制劑組與癡呆組比較，N、EN和TRT有改善（P＜0.05）。抑制劑組與溶媒對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示癡呆組大鼠在Aβ注射7d后，學習記憶能力顯著下降；而應用抑制劑SB203580后，大鼠學習記憶能力得到改善。

表1 每組動物的行為學結果（n=6，±s）

表1 每組動物的行為學結果（n=6，±s）

注：與陰性對照組比較，＊P＜0.05；與溶媒對照組比較，＃P＜0.05；與抑制劑組比較，△P＜0.05

學會標準的訓練次數(shù) 完成所有反應中錯誤反應的次數(shù) 全天總反應時間組 別4d 7d 14d陰性對照組 19.67±3.88 19.50±3.62 23.17±3.19 3.38±1.76 3.55±1.78 3.64±1.95 4d 7d 14d 4d 7d 14d 506.03±41.66 524.06±46.01 533.95±26.50癡呆組 22.50±2.95 41.50±4.95＊△51.33±6.80＊△ 3.61±1.86 5.26±0.81＊△ 6.95±1.19＊△ 520.18±35.41 933.39±35.76＊△1320.62±84.42＊△溶媒對照組 22.83±4.02 42.83±4.17 51.67±4.23 3.63±1.63 5.11±1.52 6.88±2.14 526.53±56.80 963.19±41.89 1282.60±89.66抑制劑組 23.67±3.56 30.00±5.76＃ 34.50±3.94＃ 3.54±1.57 4.06±1.25＃ 4.10±1.68＃ 537.15±56.74 660.08±41.12＃ 856.02±43.31＃

2 p-p38蛋白在大鼠海馬CA1區(qū)及嗅球的表達經(jīng)過免疫組化染色，光鏡下的p-p38蛋白免疫反應產(chǎn)物呈棕黃色，主要表達于細胞核內。由表2及圖1A-F可見，在海馬CA1區(qū)，陰性對照組各時間點可見少量p-p38蛋白表達；癡呆組在Aβ注射4d出現(xiàn)明顯的pp38蛋白表達，隨著觀察時間的延長，p-p38蛋白表達逐漸增多；且各時間點均顯著高于陰性對照組（P＜0.01）；而抑制劑組各觀察時間點，p-p38蛋白的表達介于陰性對照組和癡呆組之間，同時與溶媒對照組也明顯不同，在應用SB2035804d時，p-p38蛋白幾乎被完全抑制，而在7d，14d被部分抑制。

另外，由表2及圖2A-F可見，每組各時間點pp38蛋白在嗅球的表達均低于海馬的表達（P＜0.01），但p-p38蛋白在嗅球的表達規(guī)律與在海馬CA1區(qū)的表達規(guī)律相一致。

表2 每組大鼠海馬與嗅球p-p38蛋白的灰度（n=6，±s）

表2 每組大鼠海馬與嗅球p-p38蛋白的灰度（n=6，±s）

注：與陰性對照組比較，＊P＜0.01；與抑制劑組比較，△P＜0.01；與癡呆組7d和14d比較，▲P＜0.01；與癡呆組14d比較，★P＜0.01；與溶媒對照組比較，＃P＜0.01；與CA1區(qū)比較，※P＜0.01

組 別嗅球陰性對照組 182.24±1.49 197.08±2.19※ 180.08±1.80 194.58±1.42※ 180.69±2.05 194.22±2.38 4d CA1區(qū) 嗅球7d CA1區(qū) 嗅球14d CA1區(qū)※癡呆組 177.36±1.12＊△▲186.60±3.79＊△▲※ 168.57±2.23＊△★ 180.85±5.11＊△★※ 161.93±0.77＊△ 174.70±3.49＊△※溶媒對照組 176.98±1.48 185.91±0.58※ 167.09±2.05 183.32±1.39※ 159.55±1.48 182.52±3.20※抑制劑組 181.37±0.98＃ 194.75±2.08?！鳌睢?175.67±2.26＃ 191.55±1.62＃△※ 170.38±1.34＃ 186.65±3.47?！鳌?/p>

圖1 p-p38蛋白在Aβ誘導大鼠損傷海馬CA1的表達

圖2 p-p38在Aβ誘導大鼠損傷嗅球的表達

討 論

研究報道，p38在細胞應激時的炎癥反應，參與了風濕性關節(jié)炎等外周疾病的病理過程。近年來發(fā)現(xiàn)，除了外周的作用，p38可能作為激酶級聯(lián)中的終末激酶、參與轉錄調控、參與炎癥反應、促使tau蛋白過磷酸化、促使神經(jīng)元凋亡或與其他信號轉導通路協(xié)同介導細胞應激誘發(fā)的基因表達和酶活力改變等途徑，在AD病理機制中發(fā)揮作用［7，8］，研究顯示，在 AD發(fā)生發(fā)展中，p38的作用可能類似炎癥過程的正反饋環(huán)，除了炎癥，尚有許多物質以及AD形成中的各類神經(jīng)元和非神經(jīng)元均可誘導其產(chǎn)生效應［7，9］，這種變化不僅出現(xiàn)于大腦皮質，也出現(xiàn)在海馬及嗅球，p38的激活貫穿于AD的全過程。本研究比較了注射Aβ25-35后AD大鼠嗅球與海馬p-p38蛋白的表達狀況，結果發(fā)現(xiàn)，建模第4天p-p38蛋白在海馬及嗅球均明顯表達，隨著觀察時點的延長，于第7天和第14天表達的p-p38蛋白逐漸增多，在各觀察時點嗅球與海馬CA1區(qū)p-p38蛋白的表達規(guī)律相一致，p-p38蛋白在海馬的表達均高于嗅球的表達，提示p38信號轉導通路確實參與了AD的病理過程，海馬CA1區(qū)對Aβ25-35誘導損傷更敏感。

在傳統(tǒng)的抑制劑中，SB203580具有很強的選擇性，它可以通透細胞對細胞內的p-p38活性發(fā)揮抑制作用。研究認為，SB203580并非通過阻斷上游激酶對p38的激活，而是通過競爭結合蛋白激酶ATP-結合袋，使p-p38失去了與ATP結合的能力，抑制p38催化活性而發(fā)揮作用［10］。

本實驗用0.1nmol／μl共5μl的SB203580于 Aβ注射前30min注入大鼠側腦室，觀察大鼠各項指標的變化。與癡呆組比較，抑制劑組大鼠的學習記憶障礙明顯改善，比較海馬CA1區(qū)及嗅球的p-p38陽性細胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，不論在嗅球還是海馬，抑制劑組與癡呆組比較，在Aβ注射4d時活化的p-p38幾乎被完全抑制，而在Aβ注射7d，14d則被部分抑制，提示SB203580可能減輕的AD病理過程，有可能在AD治療中發(fā)揮作用，但是這種抑制作用并不持久，與相關報道一致［11］。分析p-p38僅被部分抑制的原因可能如下：由于p38在AD病程中處于一個類似炎癥過程的正反饋環(huán)內，新的應激以及Aβ持續(xù)存在，會不斷刺激更多p38分子活化，p38處于持久活化狀態(tài)，而抑制劑SB203580是通過與ATP競爭p38結合位點發(fā)揮作用，故無法阻斷上游激酶對p38的激活；并且，作為競爭性抑制劑，SB203580的應用劑量是有限的，不能抑制無限增長的p38與ATP結合活化。

由此得出，p38信號轉導通路的激活貫穿于Aβ25-35誘導的AD全過程，磷酸化的p38可表達于大鼠嗅覺中樞及海馬，雖然AD早期即有嗅覺障礙，但是海馬CA1區(qū)p-p38的表達比嗅球更明顯，說明海馬對Aβ25-35的損傷更敏感。p38抑制劑SB203580能部分減弱Aβ25-35的神經(jīng)毒性作用，有望成為治療AD的新靶點。然而，由于機體的復雜性、AD發(fā)病機制的復雜性及信號轉導通路的復雜性，加之，信號通路之間的串話現(xiàn)象，p38在AD發(fā)病中的作用仍需要大量的研究支持。

［1］Schiffman SS.Taste and smell losses in normal aging and disease［J］.JAMA，1997，278（16）：1357-1362.

［2］Arnold SE，Lee EB，Moberg PJ，et al．Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease［J］.Ann Neurol，2010，67（4）：462-469.

［3］劉智斌，牛文民，楊曉航，等.損毀嗅球對癡呆大鼠學習記憶功能影響作用的實驗研究［J］.陜西醫(yī)學雜志，2009，38（1）：17-19.

［4］Wilson RS，Arnold SE，Schneider JA，et al.Olfactory impairment in presymptomatic Alzheimer＇s disease［J］.Ann N Y Acad Sci，2009，1170：730-735.

［5］Wesson DW，Wilson DA，Nixon RA.Should olfactory dysfunction be used as a biomarker of Alzheimer’s disease［J］？Expert Rev Neurother，2010，10（5）：633-635.

［6］Kovács T，Cairns NJ，Lantos PL.Olfactory centres in Alzheimer＇s disease：olfactory bulb is involved in early Braak＇s stages［J］.Neuroreport，2001，12（2）：285-288.

［7］Zhu X，Mei M，Lee HG，et al.P38activation mediates amyloid-βcytotoxicity［J］.Neurochem Res，2005，30（6-7）：791-796.

［8］Cao M，Liu F，Ji F，et al.Effect of c-Jun N-terminal kinase（JNK）／p38mitogen-activated protein kinase（p38 MAPK）in morphine-induced tau protein hyperphosphorylation［J］.Behavioural Brain Research，2013，237（15）：249-255.

［9］Obata T，Brown GE，Yaffe MB.MAP kinase pathways activated by stress：The p38MAPK pathway［J］.Crit Care Med，2000，28（4Suppl）：67-77.

［10］Gum RJ，McLaughlin MM，Kumar S，et al.Acquisition of sensitivity of stress-activated protein kinases to the P38 inhibitor，SB 203580，by alteration of one or more amino acids within the ATP binding pocket［J］.J Biol Chem，1998，273（25）：15605-15610.

［11］Lenka M，Alaina JA.Targeting p38MAPK pathway for the treatment of Alzheimer＇s disease［J］.Neuropharmacology，2010，58（3）：561–568.