劉澤宇 夏書月 何巍

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素所導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，病情兇險(xiǎn)，死亡率高。失控的炎癥反應(yīng)是發(fā)病機(jī)制的核心，避免炎癥反應(yīng)失控是降低ALI病死率的關(guān)鍵。近年的研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的T細(xì)胞亞群，可以產(chǎn)生IL-17，因此稱之為Th17細(xì)胞亞群[1]。維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(Retinoid-related orphan receptor gammat，RORγt)是調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，直接決定了Th17細(xì)胞的分化能力。Th17細(xì)胞通過分泌IL-17等細(xì)胞因子，在免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，參與炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病和移植排斥等。進(jìn)一步的研究表明，Th17細(xì)胞和哮喘、COPD等多種肺部疾病具有相關(guān)性。但對(duì)于Th17細(xì)胞與ALI是否相關(guān)，目前還未見報(bào)導(dǎo)。本研究通過檢測(cè)ALI患者外周血中RORγt mRNA的表達(dá)量、Th17細(xì)胞的比例和血漿中IL-17的水平來了解Th17細(xì)胞的分化能力、數(shù)量多少和功能狀況，進(jìn)而明確Th17細(xì)胞和ALI的關(guān)系，推測(cè)Th17細(xì)胞可能發(fā)揮的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年10月至2011年12月期間，在沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院的ALI患者10例。入選標(biāo)準(zhǔn):符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)制定的《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷治療指南》所推薦的ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男性6例，女性4例，平均年齡(68±11)歲，入組時(shí)患ALI的天數(shù)為(3±1)d，氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)為(235±48)mm Hg。排除標(biāo)準(zhǔn):留取血標(biāo)本前已經(jīng)應(yīng)用了糖皮質(zhì)激素。對(duì)照組為健康志愿者10人，同樣選取男性6例，女性4例，平均年齡(65±9)歲。本研究得到了沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集標(biāo)本 清晨空腹抽取受試者外周血至少7 ml。其中5 ml用于提取RNA，1 ml用于流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，1 ml用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)RORγt mRNA的表達(dá)量 Trizol(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)法提取 RNA，配制 RNA/Primer混合物(RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司):總RNA5 μl+Oligo(dT)20 50 μM)1 μl+dNTP mix(10 mM)1 μl+ddH2O(DEPC 處理過)3 μl(補(bǔ)到 10 μl)，再配制 cDNA Synthesis Mix:10 × RTbuffer2 μl+25 mM MgCl24 μl+0.1 m DTT 2 μl+RNaseOUT(40U/μl)1 μl+SuperScriptⅢ RT(200U/μl)1 μl。將10 μl cDNA Synthesis Mix 加入 RNA/Primer混合物中，反應(yīng)后加入 RNase H降解殘留的 RNA。在 NCBI中查到RORγt的 cDNA 序 列，設(shè) 計(jì) 引 物 為:上 游 引 物5'GCAACAGCAGCAACAGGA3'、 下 游 引 物5'TCAGGGAGGCATAGGGTG3'、產(chǎn)物長(zhǎng)度為428bp(引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)。將β肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參，上游引物為:5'GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3'、下游引物為5'CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3'、產(chǎn)物長(zhǎng)度為353bp。將 PCR buffer、dNTPmix、上游引物、下游引物、Taq酶、cDNA模板、ddH2O加入一薄壁離心管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR儀為德國(guó)Promega公司產(chǎn)品)。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min。94℃變性 30s，61.5℃退火 30s，72℃延伸 40s，30 個(gè)循環(huán)。最后72℃再延伸10 min。DM2000(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用RORγt對(duì)β-actin的累積光密度(IOD)的比值作為RORγt的相對(duì)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞的比例 將外周血按1∶1的比例與RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)混勻，加入激活劑佛波酯(PMA)，離子霉素(Ionomycin)和高爾基體阻斷劑Brefeldin-A(BFA)(均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，培養(yǎng)4 h后與結(jié)合有FITC的抗人CD4單抗(購(gòu)自美國(guó)BD公司)反應(yīng)30 min。再經(jīng)過溶血素(購(gòu)自碧云天公司)裂解紅細(xì)胞，F(xiàn)ix＆perm(購(gòu)自美國(guó)Caltag公司)固定、破膜。最后與結(jié)合有PE的抗IL-17單抗(購(gòu)自美國(guó)BD公司)反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)IL-17濃度 取出包被有IL-17抗體的酶標(biāo)板(購(gòu)自美國(guó)R＆D公司)，分別加入血漿和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品并孵育。此后依次經(jīng)過與生物素化抗體、酶結(jié)合物、顯色劑、終止液的多步反應(yīng)，最后測(cè)量OD450值，計(jì)算血漿中IL-17的濃度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 首先進(jìn)行兩樣本的方差齊性檢驗(yàn)，P＞0.05為方差齊。再做兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中RORγt mRNA的表達(dá)水平 RORγt mRNA在ALⅠ組的表達(dá)水平(0.56±0.08)高于對(duì)照組(0.19±0.05)，差異顯著(P＜0.01)，見圖1。

圖1 RORγt mRNA

2.2 外周血中Th17細(xì)胞的比例 Th17細(xì)胞在ALⅠ組的比例(32.60% ±5.51%)高于對(duì)照組(12.29% ±1.71%)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，見圖2。

圖2 Th17細(xì)胞的比例

2.3 血漿中IL-17的濃度 IL-17在ALⅠ組的濃度(87.33±6.08)pg/ml明顯高于對(duì)照組(52.71±3.19)pg/ml，P ＜0.01，見圖3。

圖3 IL-17的濃度

3 討論

ALI屬于一種特殊類型的急性呼吸衰竭，具有病情兇險(xiǎn)，死亡率高的特點(diǎn)。目前認(rèn)為，失控的炎癥反應(yīng)是發(fā)病機(jī)制的核心，避免炎癥反應(yīng)失控是降低ALI病死率的關(guān)鍵，也是目前研究的熱點(diǎn)之一。

對(duì)于在免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用的輔助性T細(xì)胞(Th)，根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子的不同，傳統(tǒng)上將其分為Th1和Th2兩個(gè)亞群。Th1細(xì)胞以分泌INF-γ和IL-2為主，Th2細(xì)胞以分泌IL-4、IL-5和IL-13為主。而近年的研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的Th細(xì)胞亞群，以產(chǎn)生IL-17為主，但不能產(chǎn)生INF-γ和IL-4，因此稱之為Th17細(xì)胞亞群[1]。Th17細(xì)胞是由初始T細(xì)胞分化而來，在細(xì)胞和分子水平受到精細(xì)調(diào)節(jié)。TGF-β是啟動(dòng)Th17細(xì)胞分化的始動(dòng)因素[2]，IL-6是協(xié)同促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，而IL-23則對(duì)Th17細(xì)胞的存活和增殖發(fā)揮重要作用[3]。雖然Th17細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，但主要還是通過分泌IL-17來發(fā)揮生物學(xué)作用，廣泛參與抗感染[4]、自身免疫[5]和移植排斥[6]等。

RORγt是調(diào)節(jié) Th17細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th17細(xì)胞分化發(fā)育過程中起到極其重要的作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示，在TGF-β和IL-6的共同作用下，初始CD4+T細(xì)胞可以分化為Th17細(xì)胞，但需要RORγt的表達(dá)，即使沒有其他的外源性細(xì)胞因子，加強(qiáng)表達(dá)RORγt也足以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化[7]。當(dāng) RORγt缺乏時(shí)，Th17 細(xì)胞的數(shù)量也隨之顯著下降[8]。RORγt基因敲除的小鼠不易出現(xiàn)嚴(yán)重的自身免疫性疾病[9]，炎癥組織中 Th17細(xì)胞也明顯減少[10]。這些研究結(jié)果均提示，RORγt可以通過促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，間接起到上調(diào)炎癥反應(yīng)的作用。本研究的結(jié)果表明，在ALI患者的外周血中，淋巴細(xì)胞表達(dá)RORγt的水平較對(duì)照組明顯升高，這會(huì)有力地促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，進(jìn)而上調(diào)炎癥反應(yīng)，這與上面提到的研究結(jié)論是一致的。

雖然有多種細(xì)胞可以分泌IL-17，但I(xiàn)L-17的主要來源仍然是Th17細(xì)胞。作為一種細(xì)胞因子，參與包括哮喘和COPD在內(nèi)的多種炎癥性疾病。利用動(dòng)物模型，對(duì)Th17細(xì)胞/IL-17和多種肺部疾病之間關(guān)系所進(jìn)行的研究，已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。李鴻佳等[11]發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠外周血中Thl7細(xì)胞明顯增多，BALF中IL-17的水平顯著升高。在哮喘小鼠肺組織中，增多的Thl7細(xì)胞不但促進(jìn)中性粒細(xì)胞在局部的浸潤(rùn)，而且增強(qiáng)變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性[12]。McKinley等[13]將 Th17細(xì)胞通過靜脈注入到T細(xì)胞缺失的哮喘小鼠體內(nèi)，誘導(dǎo)出IL-17，氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集和氣道高反應(yīng)性?？傊∈篌w內(nèi)IL-17可以通過募集并激活中性粒細(xì)胞等多種方式發(fā)揮促炎作用[14]。而在 COPD 方面，Alcorn等[15]對(duì) IL-17RA 基因敲除的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，香煙暴露導(dǎo)致肺氣腫的嚴(yán)重程度較野生型小鼠減低，說明IL-17對(duì)肺氣腫的形成有促進(jìn)作用。Shen等[16]將抗IL-17抗體注入香煙暴露的小鼠腹腔內(nèi)，去除小鼠體內(nèi)的IL-17，肺組織勻漿中IL-17的濃度下降，支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞的水平降低，小氣道炎癥明顯緩解，從反面證明IL-17可以上調(diào)COPD的氣道炎癥反應(yīng)。我們的研究表明，與對(duì)照組比較，ALI患者外周血中Th17細(xì)胞的比例增加，IL-17的濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示Th17細(xì)胞可能通過分泌IL-17來上調(diào)炎癥反應(yīng)，加重炎癥反應(yīng)的失控。這與前面提到的哮喘和COPD動(dòng)物模型中所見到的情況是相吻合的。

雖然Th17細(xì)胞與多種肺部疾病相關(guān)，但與ALI是否相關(guān)，目前還未見報(bào)導(dǎo)。我們對(duì)ALI患者外周血中Th17細(xì)胞和IL-17進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn):ALI患者外周血中Th17細(xì)胞的分化加強(qiáng)，數(shù)量增多，血漿中IL-17的水平增高。據(jù)此推測(cè)，Th17細(xì)胞參與了ALI的發(fā)病過程，可能通過分泌以IL-17為主的細(xì)胞因子，加重氣道炎癥反應(yīng)。今后的研究方向包括進(jìn)一步深化對(duì)Th17細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，嘗試通過干預(yù)Th17細(xì)胞來控制炎癥反應(yīng)，改善ALI的預(yù)后。

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