許官學 石 蓓 盛 瑾 郭小英 楊文筆 雷艷娟

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內科，貴州 遵義 563003)

動物模型是研究人類急性心肌梗死(AMI)的重要工具〔1〕。研究中結扎冠狀動脈是制作AMI動物模型的常用方法。其中SD大鼠因來源方便、價格便宜、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點，常被選用制作AMI模型。然而，在AMI模型建立中肺損傷、冠狀動脈左前降支定位錯誤、麻醉和呼吸機應用不當?shù)仍?，可造成SD大鼠死亡率過高甚至制模失敗。本研究針對如何成功建立大鼠AMI模型并降低其死亡率方法進行評估分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡雄性SD大鼠，體重200～250 g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠AMI模型的建立 42只SD大鼠稱重，戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。將麻醉、備皮后的大鼠仰臥位固定于實驗用木板上，常規(guī)消毒鋪巾，頸部正中切開皮膚，甲狀腺下方1～2個氣管環(huán)狀軟骨切開氣管，插管，連接呼吸機(潮氣量3 ml/100 g;呼吸頻率100次/min;呼吸比1∶3)。胸骨左緣心臟搏動明顯處縱行切開皮膚約3 cm，經(jīng)左第3、4肋間進入胸腔。結扎左冠狀動脈前降支。利多卡因1～2滴滴于心臟表面預防心律失常。2/0縫線關閉胸腔。動物蘇醒后拔除氣管插管，8/0無損傷縫合針閉合氣管。2/0縫線縫合頸部皮膚。皮下注射2～3 ml無菌生理鹽水。大鼠先放入清潔鼠籠，站燈加熱。溫度維持在35℃ ～37℃〔3〕。大鼠完全清醒后轉至普通鼠籠中，置于27℃空調房內正常飼養(yǎng)。術后連續(xù)注射青霉素鈉3 d(40 萬 U/d)，防止切口感染〔3〕。

1.2.2 AMI模型的鑒定

1.2.2.1 心電圖 心電圖針形電極在麻醉生效后插入大鼠四肢皮下。觀察術前和術后各導聯(lián)ST段改變情況。AMI模型成功標志為心電圖肢導R波振幅明顯升高，Ⅰ、aVL導聯(lián)ST段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)0.5 h以上。

1.2.2.2 超聲心動圖檢查 大鼠AMI后4 w，再次腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，用Philips多功能超聲診斷儀在胸骨旁觀察心室壁厚度改變情況。

1.2.2.3 形態(tài)觀察 術后2只大鼠在未關胸時，沿胸腹部交界，切開皮膚至兩側前后肢連線處，于胸廓下緣切開肌肉進入腹腔，前正中線處切開肌肉向下沿長切口達膀胱水平，將肌肉向兩側牽拉，暴露腹腔。切開膈肌，注意不要損傷肺組織及前正中線旁胸廓內動脈，眼科剪沿前后肢連線剪開皮膚及胸廓，達近前肢處。向前上方抬起胸廓前壁同時，分離心臟與胸廓前壁粘連，完全暴露跳動心臟及大血管。腹腔內腸管向右方推移，可見腹后壁前方左腎及左腎動靜脈，用5 ml注射器于左腎靜脈內緩慢注入約3 ml亞甲藍，觀察心肌血運情況。

術后4 w，頸椎脫臼法處死大鼠，從大鼠劍突下剪開一個弧形切口，切口兩端延伸至大鼠腋下，小心剪開膈肌后即可看到跳動的心臟〔4〕，用無菌紗布輕輕將心臟從周圍粘連組織中剝離，離斷主動脈根部，迅速取出心臟。用生理鹽水及磷酸鹽緩沖液(PBS)各沖洗3遍，沖洗干凈心臟內積血。觀察心臟的外形變化，與相同月齡及大小的大鼠心臟比較。

1.2.2.4 組織病理學鑒定 術后4w取出心臟，沖洗凈心臟內積血后去除心房、大血管及心臟外結締組織等。10%甲醛固定，送病理切片作蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察。

2 結果

2.1 大鼠存活率 SD大鼠40只，術中死于大出血1支，死于心室顫動和惡性心律失常1只，存活率為95%。繼續(xù)觀察飼養(yǎng)4 w，1只死于不明原因，4 w時存活率為92.5%。

2.2 肉眼觀 SD大鼠冠狀動脈左前降支結扎后數(shù)分鐘可見結扎線以下左室前壁及心尖部心肌組織由紅色變?yōu)榘导t或紫紅色，并伴隨心肌運動減弱或消失。此時經(jīng)大鼠左腎靜脈注入亞甲藍可見正常血供心肌藍染，而梗死區(qū)域心肌組織無藍染現(xiàn)象。術后4 w，結扎線以下左室前壁心肌呈典型室壁瘤表現(xiàn)，左室壁變薄，呈半透明狀，局部隨心臟搏動呈反常搏動。

2.3 超聲心動圖檢查 正常組SD大鼠心臟超聲心動圖可見左室心肌厚度均勻，舒縮運動正常。AMI后4 w時超聲心動圖下見梗死區(qū)域心室壁呈室壁瘤樣改變，室壁厚度菲薄，局部向外擴張，并隨心室舒縮活動呈明顯反常搏動。見圖1。

2.4 心肌組織HE染色 術后4 w時，光鏡下見結扎線以上非心肌梗死區(qū)心肌細胞較正常對照組代償性肥大，細胞橫紋及閏盤清晰，纖維結構清晰、排列整齊，無炎癥細胞浸潤;而梗死區(qū)域心肌細胞因缺血出現(xiàn)壞死，壞死心肌表現(xiàn)為纖維化、結構排列紊亂。心肌梗死區(qū)與非梗死區(qū)界限明顯，在交界處組織中可見少量炎癥細胞浸潤。見圖2。

2.5 心肌組織Masson染色 左心室梗死區(qū)膠原纖維顯著增多，呈條索狀，部分膠原纖維融合。梗死區(qū)與非梗死區(qū)邊界清晰，可見毛細血管增生。見圖3。

圖1 AMI 4 w后心臟長軸超聲心動圖心室前壁改變

圖2 各組心肌組織HE染色

圖3 正常心肌masson染色

3 討論

AMI動物模型的建立方法目前國內外文獻報道眾多，方法已經(jīng)基本成熟，但手術成功率及老鼠死亡率等不盡相同。倪新海等〔5〕建立的Wistar大鼠AMI模型600只，術后24 h存活率70%，術后8 w存活率62%。劉元生等〔6〕報道AMI 3 w以上大鼠存活率為78.1%:Sia等〔8〕及高琴等〔9〕報道 AMI大鼠術后24 h成活率分別為49%和52.5%。本研究AMI大鼠存活率較上述報道明顯提高。

3.1 實驗動物的選擇 目前國內外常用的AMI模型的動物包括小鼠、大鼠、兔、小型豬、犬等。相對于其他實驗動物，大鼠有以下優(yōu)勢:種群純正，個體變異性小，價格低廉，基因與人類相似度高，可復制出多種人類疾病模型。在心血管疾病研究方面，因為大鼠的冠狀動脈系統(tǒng)相對穩(wěn)定、變異性低、側支循環(huán)少，是冠脈疾病模型制備及研究的良好動物模型來源〔9～11〕。為了能夠建立穩(wěn)定、可靠及重復性好的AMI模型，大鼠的選擇盡量保持種族、體重、性別、月齡的一致性，達到AMI模型標準化。

3.2 麻醉方法的選擇 對大鼠的麻醉方法常見的有腹腔注射、靜脈注射、吸入麻醉三種方法，試驗中用于麻醉藥物有戊巴比妥、水合氯醛、氯胺酮、烏拉坦、阿托品、利多卡因等。其中戊巴比妥鈉溶液或水合氯醛通過腹腔注射給藥可以達到理想的麻醉效果〔11〕，優(yōu)點為給藥途徑便利、麻醉起效快、麻醉深度適中。但在具體應用中應當警惕麻藥劑量的選擇，應當按體重計算，從低劑量開始給藥，如10%水合氯醛按照300 mg/kg為起始量，5～10 min起效，若此時麻藥仍未起效，可按50 mg/kg逐量追加給藥。反之，大鼠容易發(fā)生麻醉過深，導致術后大鼠復蘇時間延長，脫離呼吸機困難，此外還可引起實驗動物肺水腫、感染、酸堿失衡、呼吸肌麻痹、氣道分泌物過多而窒息，增加了大鼠圍術期死亡率。

3.3 氣道建立的方法 有少量報道在制備AMI模型過程中不予氣管插管〔14〕，在很短的時間迅速開胸并行冠脈結扎術。此方法在實際應用中有大量不易克服的技術弊端:技術含量高、操作難度大、圍術期存活率低?，F(xiàn)在AMI模型制備中多用小動物呼吸機維持呼吸，相對不受時間限制，術者可仔細操作，從而使AMI成功率及圍術期死亡率明顯下降?，F(xiàn)在較常用的大鼠氣管插管方法有經(jīng)口氣管插管和氣管切開插管。經(jīng)口氣管插管最符合生理狀態(tài)，且對動物機體損傷小，但技巧難度較大，對術者要求高，需要長時間訓練，在操作中若反復插管刺激，會導致氣道分泌物增加，氣道阻塞、窒息，并可出現(xiàn)喉頭損傷、誤插入食管等并發(fā)癥，嚴重時導致大鼠死亡〔15〕。本實驗選用氣管切開法，能在術中直視操作，短時間訓練及可熟練操作。需要注意的是，該方法術后可能發(fā)生氣道分泌物過多及少量積血堵塞氣道，致窒息死亡。因此術中應避免損傷血管神經(jīng)和腺體，及時清理術區(qū)積血，術后用50 ml注射器接16G靜脈留置針通過抽吸吸出氣管內痰液及血液，暢通呼吸道，提高存活率。

氣管插管呼吸機輔助呼吸開始后，從開胸結扎左前降支冠脈到關胸過程中有可能因未及時發(fā)現(xiàn)氣管插管脫落、堵塞致動物死亡。因此術中需注意:①麻醉后大鼠肢體、頭部及氣管插管后均要穩(wěn)妥固定，防止術中人為原因引起動物滑動;牢固固定手術臺板，避免因動物或手術臺板活動造成氣管插管拽脫;②氣管切開過程中需仔細操作，避免唾液腺體及氣管旁血管損傷，防止血液及分泌物流入氣管管腔內阻塞氣管及氣管插管;③保持氣管插管通暢，避免因插管彎折致堵塞。

3.4 開胸方法的改良 本文結合文獻報道作了部分改良:手術切口定位在胸骨左緣心臟搏動處，縱行切開皮膚長約3 cm，鈍性分離皮下結締組織和肌肉(胸大肌斜行，胸小肌呈縱行)，不要切斷胸大小肌。充分暴露第3、4肋間后，眼科剪平行肋骨方向分離肋間肌，直至進胸，術中注意避免過分靠近中線及側方，以防損傷胸骨旁胸廓內動脈及肺組織。進胸后換閉合小止血鉗，鈍性分離肋間肌，切斷第5肋。眼科鑷沿心臟頂部或底部小心提起心包并撕開心包膜，注意不要損傷左側心包中走行的左側膈神經(jīng)及伴行血管。通過方法改良，能在術中充分暴露心臟及大血管，并減少出血。因未切斷胸大、小肌，術后關胸時，胸大小肌能從不同方向原位覆蓋肋間切口，并與皮膚切口方向互相交錯，有效防止術后切口漏形成氣胸。

3.5 冠脈結扎部位 AMI結扎部位的選擇是整個模型的重點也是難點，尤其是左冠狀動脈前降支的定位及結扎是本模型的關鍵。開胸后能夠充分暴露心臟前壁及大血管是下一步結扎冠脈的基礎。綜合文獻報道及自身實踐操作，進針標志為左冠狀動脈主干左心耳下方2 mm，肺動脈圓錐旁出針，此時不要急于結扎，可暫時輕用力提起縫線兩端，保持張力，在此過程中動態(tài)觀察心電圖變化，必須見到ST段弓背向上持續(xù)抬高及心肌表面顏色發(fā)白，左室收縮活動減弱，初步判斷冠脈前降支確切在縫線內后再進行打結結扎。如沒有以上表現(xiàn)，或因局部刺激后血管短暫痙攣心肌變蒼白，但很快恢復正常，則表明未能成功將左前降支冠脈縫扎，立即抽出縫線，重新仔細辨認解剖標志后再次進針。結扎的深度約0.5 mm、寬度約2～3 mm，過多會導致大面積心肌因機械變性發(fā)生梗死面積過大，可導致術后心功能過差，甚至引起大鼠死亡，反之不易一次結扎成功，也可造成縫線撕脫引起大出血。本組動物有一只即因此原因出現(xiàn)大出血致死。在結扎過程中及結扎成功后可能會有AMI后心律失常出現(xiàn)，且大多是惡性室性心律失常，如室早二聯(lián)律、心室顫動，用注射器將少量利多卡因滴入心臟表面可防治惡性室性心律失常。針對術后可能出現(xiàn)的心動過緩，在心臟表面滴注阿托品，可提高心率，同時減少氣管內分泌物，建議常規(guī)備用。

3.6 脫機 不管是人類還是動物，術后停用呼吸機輔助呼吸，恢復自主呼吸都是手術的難點。實驗中需針對不同動物個體做到個體化處理。不同個體老鼠對麻醉藥物反應不一，因此術中麻醉深度不盡相同，術后需呼吸機輔助呼吸時間變化較大。當術后大鼠出現(xiàn)明顯自主呼吸并有肢體疼痛反射活動后，可試停呼吸機，停機前注意先用止血鉗夾住呼吸機的出氣口管2～3個呼吸周期，待肺充分擴張后將止血鉗松開，然后再夾住呼氣口管，觀察是否有胸廓起伏。若有自主呼吸可順利脫機。如脫機后出現(xiàn)呼吸緩慢，數(shù)分鐘無改善，須立即重新插管并聯(lián)接呼吸機，再次呼吸機輔助呼吸。

3.7 手術后措施 術后保暖，防止舌后墜，應用抗生素，保持飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，保證飼料充足等措施可以有效預防術后感染、窒息、免疫力低下所致的死亡，所以不容忽視。

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