劉 贊 盧桂蘭 黃亞蓮 吳祖榮 (海南省農(nóng)墾總醫(yī)院護理部，海南 ?？?570311)

阿爾茨海默病(AD)是表現(xiàn)為年齡依賴的整體認知能力的下降以及漸進性神經(jīng)功能退化的一類老年性疾病〔1〕。根據(jù)年齡可將AD分為兩類，＞65歲為早發(fā)性AD(EOAD)，＜65歲為晚發(fā)性AD(LOAD)，其中LOAD所占比例較大。早老素(PS)-1基因是定位于14號染色體上在進化上高度保守的基因，其編碼產(chǎn)物PS-1蛋白是定位于細胞膜上的跨膜蛋白，可能與APP的分解和腦組織β淀粉樣蛋白(Aβ)的生成有關(guān)〔2〕。在對EOAD的研究中發(fā)現(xiàn)PS-1的多態(tài)性往往與AD的發(fā)生密切相關(guān)，但對于該基因與LOAD的關(guān)聯(lián)性研究較少。Rs2256408是PS-1的一個單核苷酸多態(tài)位點(SNP)，該位點的A可能突變?yōu)镚。本文旨在研究該位點與LOAD的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 對象 嚴(yán)格根據(jù)發(fā)病時間確診LOAD患者89例，其中男∶女為56∶33，年齡66～78歲，平均70.9歲。為了保證健康對照組的可靠性，選擇80～93歲精神狀況良好的老年對照165例，男∶女為110∶55，平均年齡85.6歲。

1.2 血樣的采集及基因組DNA的提取 所有對象采集早晨空腹血液2 ml，EDTA抗凝，提取基因組DNA備用。

1.3 rs2256408多態(tài)性的檢測 根據(jù)rs2256408的序列特點在其上下游序列范圍內(nèi)設(shè)計引物，上游引物為P1(ACCATGGCTAGTGGCAGCTGTC)，下游引物為 P(ATAGGAGGAGGACAAATTTGC)，擴增片段長度為223 bp。反應(yīng)體系為:15 μl反應(yīng)體系中含有 1 μl基因組 DNA，1.5 μl 10 倍緩沖液，0.3 μl dNTP，0.15 μl引物混合物。反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)熱3 min;94℃15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s循環(huán) 11 次;94℃ 15 s，54℃ 15 s，72℃30 s，循環(huán)24次;72℃ 3 min。將PCR產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司進行基因分型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行χ2分析。

2 結(jié)果

2.1 SNP多態(tài)性分型結(jié)果的判斷 可檢測出三種基因型:AA、AG、GG，其snopshot判斷標(biāo)準(zhǔn)見圖1。

圖1 SNP分型結(jié)果

2.2 SNP的分型結(jié)果 實驗組患者中AA、AG、GG的檢出例 (率)分別為61例(68.4%)、19例(21.3%)、9例(10.1%)，對照組中的檢出例(率)分別為97例(58.8%)、33例(20.0%)、35例(21.2%)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示兩組患者的基因型分布存在顯著差異(P＜0.05)。

2.3 等位基因分布頻率的分析 等位基因A和G在實驗組中的分布頻率為79.2%(141例)和20.8%(37例)，而在對照組中的分布頻率為68.8%(227例)和31.2%(103例)。兩組患者等位基因分布頻率亦存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

＞80歲的老年人中LOAD發(fā)病率達到30%以上，是影響老年人生活質(zhì)量重要的因素之一。AD患者腦組織重要的特征是形成大量的老年斑并且發(fā)生神經(jīng)元纖維的纏結(jié)。老年斑的形成主要是由Aβ代謝異常引起的，在正常生理條件下該蛋白的產(chǎn)生、降解和清除都維持應(yīng)有的平衡。當(dāng)這種平衡被打破，該蛋白通過自身聚集而產(chǎn)生可溶性極弱的沉淀，從而形成老年斑〔3〕。大量的研究證明，AD與某些基因的危險等位基因密切相關(guān)，并且受到環(huán)境的共同作用〔4〕。目前比較確定的LOAD危險因子主要是載脂蛋白E(aPOE-4)等位基因，但該基因不是所有 AD 發(fā)生的必要條件〔5，6〕。

PS基因的突變在早發(fā)性AD中被廣泛發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)有超過60種突變被認為與EOAD有關(guān)。但是對于該基因與LOAD的相關(guān)性，目前報道較少。Rs2256408是PS-1的一個SNP位點，本研究結(jié)果說明PS-1基因SNP位點rs2256408多態(tài)性與LOAD具有密切的關(guān)聯(lián)，基因型AA可能對其發(fā)生具有促進作用，而等位基因T則可能是LOAD發(fā)生的抑制因素。

PS-1基因表達產(chǎn)物PS-1主要參與Aβ的前體蛋白App的代謝，其突變可能影響App的加工、轉(zhuǎn)運及其與細胞骨架蛋白之間的相互作用，增加了較長的Aβ分泌，從而引起其聚合及沉淀，導(dǎo)致老年斑的形成，引發(fā)了AD〔6〕。所有的突變都具有兩面性，本研究中rs2256408多態(tài)位點的AA純合子的存在更容易導(dǎo)致LOAD的發(fā)生，而突變型純合子GG則可能不利于LOAD的發(fā)生。當(dāng)然，鑒于樣本的局限性，本實驗的結(jié)論尚有待于在更大量樣本的基礎(chǔ)上進行更深入的驗證。

1 Tanzi RE.A genetic dichotomy model for the inheritance of Alzheimer's disease and common age-related disorders〔J〕.J Clin Invest，1999;104:1175-9.

2 Rosenberg RN.The molecular and genetic basis of AD:the end of the beginning〔J〕.Neurology，2000;54:2045-54.

3 Nunan J，Small D.Regulation of APP cleavage by a-，β-，and γ-secretases〔J〕.FEBS Lett，2000;483:6-10.

4 Pedersen NL.Reaching the limits of genome-wide significance in Alzheimer disease〔J〕.JAMA，2010;303(18):1864-5.

5 Rogaeva E，Tandon A，George H.Genetic markers in the diagnosis of Alzheimer's disease〔J〕.J Alzheimer's Dis，2001;3:293-304.

6 方 謹，張連峰，秦 川.早老素與阿爾茨海默癥的研究進展〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008;18(4):70-2.