楊長(zhǎng)命 劉洪玲 李文思 陳學(xué)軍 (遼寧醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 錦州 200)

結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸良性腫瘤，是結(jié)腸腺癌形成的一個(gè)必然經(jīng)過，因此積極診斷和治療結(jié)腸腺瘤是減少結(jié)腸腺癌發(fā)病的重要途徑。Livin和Caspase-3是腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用的相關(guān)蛋白。本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法和Western印跡方法檢測(cè)結(jié)腸腺癌、結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸正常黏膜中Livin和Caspase-3的表達(dá)情況，探討其在結(jié)腸腺癌中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取2008年1月至2012年1月我院病例完整的89例結(jié)腸腺癌手術(shù)存檔蠟塊，患者術(shù)后均經(jīng)兩位病理科醫(yī)師確診為結(jié)腸腺癌，術(shù)前均未接受化療、放療及其他治療，其中男50例，女39例，年齡28～82(平均55)歲;高-中分化65例，低分化24例;TNM 分期，Ⅰ ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期39例。89例病例中有39例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，50例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。50例結(jié)腸腺瘤手術(shù)存檔蠟塊，經(jīng)病理診斷學(xué)確診為腺瘤。癌旁5 cm以外結(jié)腸組織均未見癌組織浸潤(rùn)作為正常組40例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋。同時(shí)收集50例新鮮結(jié)腸腺癌、癌旁組織(距癌邊緣5 cm以內(nèi))和結(jié)腸正常黏膜組織(距癌邊緣5 cm以外)標(biāo)本放入－80℃冰箱冷藏待Western印跡法檢測(cè)。

1.2 主要試劑 采用免疫組化PV-9000和Western印跡法，一抗為兔抗人Lvin單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和兔抗人Caspase-3單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。工作濃度1∶100，免疫組化和Western印跡所用試劑盒均由北京中衫生物有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)PV-9000兩步法 切片厚4 μm，脫蠟至水。置于3%H2O2內(nèi)10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性。高壓抗原修復(fù)后，室溫自然冷卻，滴加一抗，4℃冰箱過夜;PBS液沖洗2 min 3次，滴加試劑1(聚合物輔助劑)，37℃溫箱內(nèi)孵育20 min;PBS液沖洗2 min 3次，滴加試劑2(辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG多聚體)，37℃溫箱內(nèi)孵育30 min;PBS液沖洗2 min 3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。每批均設(shè)已知陽(yáng)性切片作對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 Western印跡方法 分別取凍存的不同結(jié)腸組織各50 mg，稱重，粉碎、低溫18 000 r/min、離心30 min、取上清液。試驗(yàn)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管、空白管，在波長(zhǎng)為650 nm的條件下測(cè)定OD值。取50 μl蛋白樣品，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，90 V，1.5 h。轉(zhuǎn)膜至醋酸纖維素膜上，TBS液洗膜10 min，5%脫脂奶粉封閉過夜。TTBS洗滌2次，5 min/次，分別加入一抗，二抗，室溫孵育，加入堿性磷酸酶底物，顯色液顯色。UPV掃描儀掃描成像。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 免疫組化結(jié)果判定及分析方法 Livin和Caspase-3兩者均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，Livin也可以在細(xì)胞核表達(dá)，免疫組化陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，且其著色強(qiáng)于背景非特異性染色，兩人雙盲法觀察組織切片，每例切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(400倍)進(jìn)行結(jié)果判定。按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度:無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分。染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分相乘，0分為陰性“－”，1～3分為弱陽(yáng)性“+”，4～5分為中度陽(yáng)性“?”，≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性“?”。

1.4.2 Western印跡結(jié)果判定 Livin蛋白在33 kD處顯示特異性條帶，設(shè)分子量為42 kD β-actin為內(nèi)參，Caspase-3蛋白在33 kD處顯示特異性條帶，設(shè)分子量42 kD β-actin為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。分析Livin與Caspase-3蛋白間關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Livin及Caspase-3蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達(dá) Livin及Caspase-3蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達(dá)，均有顯著差異(P＜0.05)。見表1。

表1 Livin及Caspase-3蛋白在不同結(jié)腸組織中的陽(yáng)性表達(dá)〔n(%)〕

2.2 結(jié)腸腺癌中Livin與Caspase-3蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 Livin蛋白在TNMⅢ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率顯著高于TNMⅠ～Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05);在外膜浸潤(rùn)組陽(yáng)性率高于肌層以內(nèi)浸潤(rùn)組，低分化組Livin蛋白陽(yáng)性率顯著高于高-中分化腺癌組(P＜0.05)，但Livin蛋白的表達(dá)量與腫瘤大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)。Caspase-3蛋白在TNMⅢ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率顯著低于TNMⅠ～Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;在外膜浸潤(rùn)組陽(yáng)性率低于肌層以內(nèi)浸潤(rùn)組，在低分化組Caspase-3蛋白陽(yáng)性率顯著低于高-中分化腺癌組(P＜0.05)，但Caspase-3蛋白的表達(dá)量與腫瘤大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見表2。

表2 結(jié)腸腺癌中Livin與Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3 Livin和Caspase-3蛋白在結(jié)腸腺癌中表達(dá)的相關(guān)性 應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析，在結(jié)腸腺癌中Livin與Caspase-3蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(r=－0.219，P＜0.05)。

2.4 Western印跡結(jié)果 應(yīng)用抗Livin單克隆抗體檢測(cè)，在約33 kD處出現(xiàn)特異性染色條帶;應(yīng)用抗Caspase-3單克隆抗體檢測(cè)，在約33 kD處出現(xiàn)特異性染色條帶，以β-actin(42 kD)處作內(nèi)參對(duì)照(圖1)。對(duì)50例結(jié)腸腺癌、癌旁、正常組織的Western印跡結(jié)果進(jìn)行灰度測(cè)定和分析，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腺癌組織中Livin蛋白的表達(dá)量明顯高于癌旁及正常結(jié)腸組織(P＜0.05)，結(jié)腸腺癌組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)量明顯低于癌旁及正常結(jié)腸組織(P＜0.05)。見表3。

圖1 各結(jié)腸組織Livin、Caspase-3 Western印跡表達(dá)情況

表3 Western印跡檢測(cè)Livin和Caspase-3蛋白在各結(jié)腸組織中的表達(dá)(s)

表3 Western印跡檢測(cè)Livin和Caspase-3蛋白在各結(jié)腸組織中的表達(dá)(s)

N1為正常組，N2為癌旁組織，N3為高分化腺癌，N4為中分化腺癌，N5 為低分化腺癌，1)與 N3、N4、N5組比較:P ＜0.05

N1 50 0.865 4±0.065 01) 0.196 7±0.023 71)N2 50 0.643 2±0.045 71) 0.287 3±0.014 61)N3 16 0.429 8±0.077 6 0.487 7±0.023 5 N4 23 0.325 8±0.075 7 0.567 7±0.058 9 N5 11 0.309 7±0.065 6 0.632 2±0.040 8

3 討論

Livin蛋白的表達(dá)具有明顯的組織選擇性，現(xiàn)已證實(shí)在很多惡性腫瘤中有Livin蛋白的過度激活及表達(dá)，其中包括黑色素瘤、淺表性膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及卵巢癌等〔1～5〕。本研究提示Livin在蛋白水平上表達(dá)上調(diào)可能在促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化中起著重要作用。鄒愛民等〔6〕在12種腫瘤細(xì)胞系和50例不同腫瘤組織中檢測(cè)了Livin蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Livin蛋白在8個(gè)細(xì)胞系中有陽(yáng)性表達(dá)，本文中腫瘤組織的Livin表達(dá)均高于相應(yīng)的癌旁組織，分析其與結(jié)腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，隨著結(jié)腸腺癌臨床分期的增加，Livin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率及蛋白表達(dá)量亦顯著升高，而與腫瘤的直徑無(wú)關(guān)，與腫瘤的病理分級(jí)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著關(guān)系。Yagihash等〔7〕研究證明，用熒光定量RT-PCR檢測(cè)多種消化道腫瘤細(xì)胞系，包括胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌以及肝癌，發(fā)現(xiàn)胃腸道腫瘤中存在Livin mRNA過表達(dá)，與人消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生存在一定關(guān)系。在胃腸道腫瘤患者的血清中抗Livin抗體也顯著升高，預(yù)示Livin可作為一種新腫瘤抗原來(lái)檢測(cè)胃腸道腫瘤。

活化的Caspase-3執(zhí)行效應(yīng)Caspase的作用，非選擇性分裂水解其他蛋白、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶以及本身，激活DNA片段因子，導(dǎo)致DNA降解、核漿碎裂、細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)顯示Caspase-3蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常結(jié)腸組織及癌旁組織。Livin能夠與Caspases蛋白結(jié)合發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。它特異性表達(dá)于人的胚胎組織、胎盤組織及大多數(shù)人類實(shí)體瘤細(xì)胞。此外，在正常成人組織的表達(dá)見于心臟、脾、卵巢、肺、腦、骨骼肌和淋巴細(xì)胞，但含量很低〔8〕。Kasof等〔9〕證明 Livin能夠直接抑制Caspase-3、-7、-9的酶水解作用。Livin抑制Caspases活性的作用是由BIR結(jié)構(gòu)域來(lái)完成的，可能阻止Caspase蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)執(zhí)行蛋白切除功能。Livin的RING結(jié)構(gòu)域可引起Caspase蛋白的降解，發(fā)揮其抗凋亡作用。

聯(lián)合檢測(cè)Livin和Caspase-3蛋白的表達(dá)可能作為結(jié)腸癌診斷的指標(biāo)之一，同時(shí)Livin在結(jié)腸癌中過度表達(dá)，有望成為結(jié)腸癌靶向治療的一個(gè)新的分子靶點(diǎn)，進(jìn)一步提高結(jié)腸癌臨床治療效果。Livin蛋白高表達(dá)、Caspase-3蛋白低表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過檢測(cè)Livin、Caspase-3蛋白表達(dá)情況對(duì)患者的預(yù)后作出評(píng)估。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程受諸多因素的影響，是多種基因、蛋白相互協(xié)助作用的結(jié)果，因此，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

1 Ross L，Bette Caan，Rowan T，et al.Low-fat dietary pattern and risk of invasive breast cancer〔J〕.JAMA，2006;295(6):629-42.

2 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curr Biol，2000;10(21):1359-66.

3 Gazzanign P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin，Survivin and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder Cancer〔J〕.Ann Oncol，2003;14(1):85-90.

4 Kim DK，Alvarado CS，Abramowsky CR，et al.Expression of inhibit or ofapoptosis protein(IAP)Livin by neuroblastoma cells:correlation with prog nositic factions and outcome〔J〕.Pediator Dev Pathol，2005;8(6):621-9.

5 Nedelcu T，Kubista B，Koller A，et al.Livin and Bcl-2 expression in high grade osteosarcoma〔J〕.Cancer Res Clin Oncol，2008;134(2):237-44.

6 鄒愛民，沈建軍，高 萍，等.惡性腫瘤細(xì)胞及組織中凋亡抑制蛋白livin的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.腫瘤，2007;27(7):570-2.

7 Yagihash IA，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of anti-livin-body in gastrointestinal cancer patients〔J〕.Clin Chem，2003;49(7):1206-8.

8 Ashhab Y，Alian A，Poliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological propenies and tissue distribution pattern〔J〕.FEBS Lett，2001;495(12):56-60.

9 Kasof GM，Comes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member〔J〕.Biol Chem，2001;276(5):3238-46.