羅阿麗，王唯析，強(qiáng) 輝，靳 輝，陳國(guó)敏

1)西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院病理科 西安 710061 2)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系 西安 710061 3)陜西省人民醫(yī)院骨科 西安 710068

在鎮(zhèn)痛的研究中，有學(xué)者[1]發(fā)現(xiàn)存在著脊髓-丘腦中央下核(thalamic nucleus submedius, Sm)-腹外側(cè)眶皮層(ventrolateral orbital cortex, VLO)-導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(periaqueductal gray, PAG)-脊髓痛覺(jué)調(diào)制反饋環(huán)路，在該環(huán)路中，阿片和(或)5-羥色胺(5-HT)誘發(fā)的抗傷害性效應(yīng)可能是通過(guò)抑制Sm內(nèi)GABA能突觸前終末對(duì)VLO投射神經(jīng)元的緊張性抑制作用而實(shí)現(xiàn)的[2]，但缺乏GABA及其受體參與痛覺(jué)調(diào)制的形態(tài)學(xué)依據(jù)[3]。作者采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)逆行追蹤方法、HRP組化和GABA免疫組化雙標(biāo)電鏡技術(shù)觀察Sm內(nèi)GABA纖維終末與VLO投射神經(jīng)元之間的突觸聯(lián)系，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠18只，體質(zhì)量160～180 g，雌雄各半，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，10 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，將大鼠置于腦立體定位儀上，參照Paxinos等[4]編制的大鼠腦立體定位圖譜，切開(kāi)顱頂皮膚及皮下組織，在前囟前3.2 mm、中線(xiàn)左旁2.0 mm處行顱骨鉆孔，將微玻管(外徑35 μm)插入腦表面下4.5～4.6 mm的VLO內(nèi)，緩慢注射200 g/L HRP(Sigma公司)0.2 μL。48 h后過(guò)量水合氯醛腹腔麻醉，開(kāi)胸經(jīng)左心室插管，先以100 mL 溫生理鹽水沖洗血管，繼而灌注500 mL 40 g/L多聚甲醛-0.75 g/L戊二醛-75 g/L苦味酸-0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB)(pH 7.4)固定液，灌注速度先快后慢，持續(xù)約1 h。灌畢立即取腦，切取含注射部位和Sm的腦組織塊，40 g/L多聚甲醛-0.1 mol/L PB(pH 7.4)固定液后固定4～6 h。置100～200 g/L蔗糖-PBS(4 ℃)中浸泡過(guò)夜，至腦塊下沉至瓶底。振動(dòng)切片機(jī)冠狀連續(xù)切片，片厚50 μm。 Sm部位切片隔2張取1張，分3套收集于0.1 mol/L PB(pH 7.4)內(nèi)，分別用于HRP組化染色、GABA免疫組化染色以及HRP組化-GABA免疫組化染色。

1.2HRP組化染色四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma公司)-鎢酸鈉(ST)呈色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-Co+-H2O2加強(qiáng)染色，中性紅復(fù)染。

1.3GABA免疫組化染色采用ABC漂浮染色法，其中GABA抗體(按11 000稀釋)購(gòu)自Sigma公司，生物素結(jié)合的羊抗兔IgG (按1200稀釋)、ABC試劑盒購(gòu)自Vector公司。染色步驟按說(shuō)明依次進(jìn)行，DAB顯色，甲苯胺藍(lán)復(fù)染。用PBS(pH 7.4)代替GABA抗體作為陰性對(duì)照。

1.4HRP組化-GABA免疫組化染色切片置于250 g/L蔗糖-100 g/L甘油-0.05 mol/L的PB(冰晶保護(hù)液，pH 7.4)中孵育0.5～1 h，移入液氮內(nèi)快速凍融[5]后再放回冰晶保護(hù)液內(nèi)。移切片入TBS(體積分?jǐn)?shù)20%羊血清-0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液-0.09 g/L NaCl, pH 7.4)中孵育0.5 h。依次進(jìn)行HRP組化染色、GABA免疫組化染色，鋨酸固定、梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹(shù)脂浸透、修塊、Epon812平板包埋、聚合、超薄切片、鈾鉛各染1 min等步驟。日本日立H-600 透射電鏡下觀察、拍照。

1.5數(shù)據(jù)處理每只動(dòng)物選3張切片，應(yīng)用Leica Q550CW圖像分析系統(tǒng)在20倍視野下計(jì)數(shù)Sm內(nèi)HRP陽(yáng)性神經(jīng)元、GABA陽(yáng)性神經(jīng)元及所有神經(jīng)元，計(jì)算陽(yáng)性神經(jīng)元占神經(jīng)元總數(shù)的比例。電鏡下觀察并計(jì)數(shù)軸-體突觸、軸-樹(shù)突觸，計(jì)算相應(yīng)比例。

2 結(jié)果

2.1HRP逆行追蹤神經(jīng)元的分布經(jīng)TMB-ST染色后，見(jiàn)HRP標(biāo)記的神經(jīng)元分布于Sm(乳頭體丘腦束背內(nèi)側(cè)部)內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色、粗顆粒狀；經(jīng)DAB-Co+-H2O2加強(qiáng)染色后呈黑色，分布于神經(jīng)元胞體及突起內(nèi)，其中Sm腹側(cè)部的陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯多于背側(cè)部。多數(shù)陽(yáng)性神經(jīng)元為多極神經(jīng)元，大小不等、形態(tài)各異，可見(jiàn)數(shù)個(gè)短的陽(yáng)性突起；少數(shù)為雙極神經(jīng)元，胞體多呈梭形(圖1A)，約有60.24%的神經(jīng)元被標(biāo)記。

2.2GABA陽(yáng)性神經(jīng)元的分布光鏡下，大鼠Sm內(nèi)可見(jiàn)大量呈顆粒狀的GABA纖維終末，免疫組化反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。另可見(jiàn)少數(shù)散在的類(lèi)圓形的GABA陽(yáng)性神經(jīng)元，該神經(jīng)元突起短而少，胞質(zhì)內(nèi)有免疫反應(yīng)產(chǎn)物，胞核及胞膜上未見(jiàn)明顯著色(圖1B)，推測(cè)其可能為GABA能中間神經(jīng)元。該類(lèi)神經(jīng)元約占神經(jīng)元總數(shù)的2.17%。

2.3雙標(biāo)電鏡觀察結(jié)果電鏡下HRP反應(yīng)產(chǎn)物為高電子密度的黑色團(tuán)塊狀物，主要分布于神經(jīng)元的核周質(zhì)及突起內(nèi)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)其分布，HRP陽(yáng)性樹(shù)突上有大量的樹(shù)突棘。GABA反應(yīng)產(chǎn)物為較高電子密度的小顆粒狀物，主要分布于纖維終末胞質(zhì)及突觸囊泡內(nèi)。GABA纖維終末與HRP神經(jīng)元胞體及樹(shù)突間建立了對(duì)稱(chēng)性或非對(duì)稱(chēng)性突觸(圖1C、D、E)。其中GABA纖維終末與HRP陽(yáng)性神經(jīng)元胞體所建立的突觸均為對(duì)稱(chēng)性突觸。 對(duì)稱(chēng)性突觸表現(xiàn)為突觸前、后膜基本對(duì)等增厚，突觸間隙較窄，突觸前膜內(nèi)含有豐富的較小的扁平囊泡。非對(duì)稱(chēng)性突觸表現(xiàn)為突觸前、后膜厚度不一，突觸后膜較厚，且膜下有致密物質(zhì)附著，突觸間隙寬于對(duì)稱(chēng)性突觸，突觸囊泡為稍大的圓形囊泡。

由于觀察視野及標(biāo)本數(shù)量受限，該實(shí)驗(yàn)在電鏡下未觀察到GABA免疫標(biāo)記神經(jīng)元。

圖1 HRP標(biāo)記及HRP-GABA雙標(biāo)電鏡結(jié)果

作者觀察到的48個(gè)軸突與HRP陽(yáng)性神經(jīng)元胞體形成的軸-體突觸結(jié)構(gòu)中，有11個(gè)(22.92%)GABA陽(yáng)性軸突和HRP陽(yáng)性胞體形成的突觸，其突觸類(lèi)型均為對(duì)稱(chēng)性的，且在一個(gè)HRP陽(yáng)性神經(jīng)元切面上，可見(jiàn)到1～2個(gè)GABA陽(yáng)性軸突終末與其形成突觸。在62個(gè)軸突和HRP陽(yáng)性神經(jīng)元樹(shù)突形成的軸-樹(shù)突觸結(jié)構(gòu)中，有7個(gè)(11.29%)GABA陽(yáng)性軸突與HRP陽(yáng)性樹(shù)突發(fā)生突觸聯(lián)系，其中對(duì)稱(chēng)性突觸有3個(gè)，非對(duì)性的突觸聯(lián)系有4個(gè)。

3 討論

3.1Sm內(nèi)GABA能神經(jīng)元及纖維終末的來(lái)源報(bào)道[6]稱(chēng)，大鼠Sm內(nèi)無(wú)GABA能神經(jīng)元，但該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大鼠Sm內(nèi)散在分布少量GABA能神經(jīng)元，推測(cè)其屬于中間神經(jīng)元，與上述報(bào)道不符。若要進(jìn)一步證實(shí)，須借助免疫原位雜交、免疫熒光雙標(biāo)等方法進(jìn)行辨別及確認(rèn)。該研究發(fā)現(xiàn)Sm內(nèi)含豐富的GABA纖維終末，與文獻(xiàn)[6]相符。有文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，丘腦網(wǎng)狀核和外側(cè)膝狀體核有大量的GABA能神經(jīng)元胞體，其發(fā)出的軸突主要投射到Sm及中央丘腦體感中繼核，且在Sm內(nèi)神經(jīng)元胞體和神經(jīng)氈上分布有GABAA、GABAB受體，推測(cè)大鼠Sm內(nèi)的GABA能纖維終末可能主要來(lái)自丘腦網(wǎng)狀核和外側(cè)膝狀體核，也可能來(lái)自Sm內(nèi)固有GABA能神經(jīng)元。

3.2Sm的纖維聯(lián)系及其功能Sm內(nèi)的傳入和傳出纖維聯(lián)系十分廣泛。在大鼠，Sm除接受脊髓背角Ⅰ層神經(jīng)元的投射外，也接受來(lái)自Ⅴ～Ⅶ層的投射。大鼠Sm內(nèi)神經(jīng)元主要上行投射到同側(cè)前額VLO，VLO又返回性地投射到同側(cè)Sm并與體感皮層聯(lián)系。研究[1]表明，Sm具有緊張性下行抑制作用，并且這些效應(yīng)可通過(guò)毀損或抑制VLO或PAG所阻斷。文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道在痛覺(jué)調(diào)制方面，Sm-VLO-PAG可能構(gòu)成一個(gè)痛覺(jué)調(diào)制通路，傷害性刺激激活Sm，經(jīng)VLO轉(zhuǎn)而激活PAG，通過(guò)腦干下行抑制系統(tǒng)在脊髓水平調(diào)制傷害感受性輸入，從而產(chǎn)生痛覺(jué)的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)。Sm可能在傳導(dǎo)針刺信息尤其是細(xì)纖維的傳入信息和在脊髓水平以上產(chǎn)生鎮(zhèn)痛具有重要意義[10]。

3.3Sm內(nèi)VLO投射神經(jīng)元的相關(guān)受體分布研究[7-8]證實(shí)，大鼠Sm內(nèi)有豐富的GABA能纖維終末和GABAA、GABAB受體分布，但不清楚Sm內(nèi)VLO投射神經(jīng)元是否表達(dá)這些受體。實(shí)驗(yàn)[11-12]表明Sm內(nèi)微量注射GABAA受體的拮抗劑荷包牡丹堿可劑量依賴(lài)性地抑制大鼠甩尾反射，這種效應(yīng)可被阿片受體拮抗劑納洛酮阻斷。Sm內(nèi)微量注射5-HT也可明顯抑制大鼠甩尾反射，并被5-HT2受體拮抗劑所拮抗。Sm內(nèi)有μ-受體[13]和5-HT受體[14]的分布，但不清楚Sm內(nèi)GABA能突觸前終末上是否有這些受體分布， 5-HT能亞受體在分布上有何差異，阿片肽和5-HT通過(guò)何種方式抑制GABA能突觸前終末或遞質(zhì)的釋放，這些問(wèn)題都是闡明Sm-VLO-PAG痛覺(jué)調(diào)制通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵問(wèn)題。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Sm內(nèi)VLO投射神經(jīng)元的胞體、樹(shù)突周?chē)嬖贕ABA纖維終末，且它們之間建立了對(duì)稱(chēng)性和(或)非對(duì)稱(chēng)性突觸聯(lián)系，但在突觸后膜上存在何亞型的GABA受體，GABA纖維終末是否還受5-HT能和(或)阿片能纖維終末的突觸前調(diào)節(jié)，仍有待進(jìn)一步探討。

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