周中華， 肖志杰， 鄧 可， 潘金保， 張 詠， 王 鵬

隨著我國(guó)人口老齡化程度的逐步加深，腦血管疾病的發(fā)病率逐年升高，全國(guó)每年新發(fā)病例250萬(wàn)，死于腦血管病超過(guò)150萬(wàn)，幸存者600萬(wàn)～700萬(wàn)，殘疾率高達(dá)75%，目前腦血管病年增長(zhǎng)率高達(dá)8.7%，中青年腦梗死的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)［1，2］。腦梗死是腦血管疾病中最常見(jiàn)的類型，其發(fā)病率在腦血管病中高達(dá)60% ～80%［3］，腦梗死由于其高發(fā)病率，高致死率、高致殘率而給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死是腦梗死中最常見(jiàn)的類型，其基本病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化。研究表明高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)的高水平能防止動(dòng)脈粥樣硬化從而減少腦血管病的發(fā)生［4，5］。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)［6］，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ABCA1)是在合成HDL-C的起始步驟中起重要作用的一類跨膜糖蛋白，在膽固醇代謝，清除組織內(nèi)過(guò)多膽固醇，抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面發(fā)揮決定性作用。ABCA1R219K是ABCA1基因的重要的單核苷酸多態(tài)性，研究［7］表明R219K可減輕冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度。同時(shí)有研究［8～11］表明，R129K的功能受到性別、年齡、種族、環(huán)境等多方面因素的影響。本實(shí)驗(yàn)選取ABCA1 R219K基因多態(tài)性與腦梗死關(guān)系進(jìn)行研究。腦梗死OCSP分型主要通過(guò)患者發(fā)病時(shí)的臨床表現(xiàn)進(jìn)行分型，不依賴于影像學(xué)檢查，專業(yè)醫(yī)務(wù)人員之間診斷一致性高，本研究對(duì)ABCA1 R219K與中國(guó)湖南地區(qū)漢族人群血脂水平、不同OCSP分型腦梗死相關(guān)性進(jìn)行病例對(duì)照研究。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 279例腦梗死患者來(lái)源于2001年2月～2002年11月在湘雅二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦卒中患者。腦梗死組包括部分前循環(huán)梗死173例，后循環(huán)梗死29例，腔隙性梗死77例，未收集到完全前循環(huán)梗死病例，其中男性162例，女性117例，平均年齡62.5±11.4歲。腦梗死患者均符合全國(guó)第四屆腦血管病會(huì)議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。351例正常對(duì)照組，為長(zhǎng)沙市雨花區(qū)普查和同期門診體檢的非心腦血管疾病人群，其中男性201例，女性150例，平均年齡61.6±7.0歲。通過(guò)問(wèn)卷訪談收集研究對(duì)象的基本資料。凡出現(xiàn)下列情況者予以剔除:伴隨腦出血、周圍血管疾病、大動(dòng)脈炎、自身免疫疾病、明顯肺部感染、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良。

1.2 研究方法 采集清晨空腹靜脈血3～5ml，采用低滲溶血、三氯甲烷法抽提外周白細(xì)胞基因組DNA、用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定ABCA1 R219K基因多態(tài)性。引物由上海生工生物工程公司合成。上游引物:5’-GTATTTTTGCAAGGCTACCAGTTACATTTGACAA-3’，下游引物:5’-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGGAA-3’。10L PCR反應(yīng)體系含:基因組DNA 0.2～0.5g，上游和下游引物分別為10pmol/L，4 × dNTP 0.25mmol/L，Taq 酶 0.5U，10Taq 酶緩沖液 1L，MgCl22mmol/L。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 4min;反應(yīng)循環(huán):變性 94℃ 50s、退火 58℃ 50s、延伸 72℃ 1 min，循環(huán)32次;最后72℃延伸10min。限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系20L:PCR產(chǎn)物10L，EcoN1 3U，10 NEBuffer4(含BSA)2L，37℃消化6h。8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，以 pUC19DNA/MspI酶解片斷作為DNA片斷的標(biāo)準(zhǔn)物，于恒壓(80V)下電泳2～3h。ABCA1 R219K產(chǎn)物片斷總長(zhǎng)度為177bp，經(jīng)特異性限制內(nèi)切酶消化后，可出現(xiàn)3種片段大小的組合。分別為 RR:177bp;RK:177bp，107bp，70bp;KK:107bp，70bp(見(jiàn)圖1)。將RR型和KK型進(jìn)行DNA序列測(cè)定。由測(cè)序圖譜(見(jiàn)圖2)可以看出，ABCA1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列RR型中的堿基C(見(jiàn)圖2中箭頭所指)突變?yōu)镵K型中的T(見(jiàn)圖2中箭頭所指)，即互補(bǔ)鏈中的G突變?yōu)锳，相應(yīng)氨基酸編碼由AGG(精氨酸)變?yōu)锳AG(賴氨酸)。

1.3 血脂測(cè)定 采用酶法測(cè)定血清TC和TG;用磷鎢沉淀法測(cè)定HDL-C;LDL-C采用公式計(jì)算;圓周免疫法測(cè)定ApoA1和ApoB100;ELISA雙抗夾心法測(cè)定Lp(a)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以χ±s表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)先行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，兩組間比較采用 t檢驗(yàn)，2組以上采用One way ANOVA檢驗(yàn)，用LSD方法進(jìn)行兩兩比較。分類資料采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型評(píng)判腦梗死危險(xiǎn)因素作用的大小，分別計(jì)算各自的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)。

圖1 ABCA1 R219K PCR產(chǎn)物酶切片斷8%聚丙烯酰胺凝膠電泳譜

圖2 PCR產(chǎn)物測(cè)序圖譜

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組與對(duì)照組一般資料比較 見(jiàn)表1。腦梗死組與對(duì)照組在性別、年齡、體重指數(shù)比較上，差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在腦梗死常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素如收縮壓、舒張壓、高血壓病史(率)、糖尿病史(率)、卒中家族史(率)、飲酒史(率)及吸煙史(率)上，腦梗死組比對(duì)照組明顯增高，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 腦梗死組與對(duì)照組生化指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。腦梗死組 BS、TG、TC、LDL-C、CREA 的水平高于與對(duì)照組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但CREA在正常范圍，無(wú)臨床意義;腦梗死組HDL-C水平顯著低于對(duì)照組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 OCSP各型腦梗死組與對(duì)照組的血脂比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組血脂水平比較，部分前循環(huán)梗死組、后循環(huán)梗死組及腔隙性梗死組的TG均高于對(duì)照組，差異性顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);OCSP各型梗死組HDL-C均低于對(duì)照組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。部分前循環(huán)梗死組的TG、LDL-C、ApoB高于對(duì)照組，ApoA-1低于對(duì)照組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);不同OCSP分型腦梗死組血脂間比較，部分前循環(huán)梗死組ApoB高于腔隙性梗死組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其他各項(xiàng)血脂指標(biāo)組間比較，差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 腦梗死組與對(duì)照組ABCA1 R219K基因型的比較 見(jiàn)表4。腦梗死組RR型頻率高于對(duì)照組，差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，腦梗死組與對(duì)照組ABCA1 R219K其余各基因型分布頻率比較，差異均不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 ABCA1 R219K基因型對(duì)血脂和脂蛋白水平的影響 見(jiàn)表5。ABCA1 R219K各基因型組間TG、TC、HDL-C、LDL-C、ApoB、ApoA-1、LP(a)水平差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各基因型組兩兩比較顯示，KK基因型組的 TG、TC、HDL-C和ApoA-1水平均高于RK和RR基因型組，更進(jìn)一步比較，KK基因型組的TG水平高于RR基因型組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，KK基因型組的TC、HDL-C、ApoA-1水平均高于RK基因型組，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.6 ABCA1 R219K基因型與腦梗死OCSP分型比較 見(jiàn)表6。腦梗死各OCSP分型(未收集到全前循環(huán)梗死病例)的ABCA1 R219K基因型比較，差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 腦梗死組與對(duì)照組一般臨床資料比較

表2 腦梗死組與對(duì)照組生化指標(biāo)比較(χ±s)

表3 OCSP各型腦梗死與對(duì)照組的血脂比較

表4 腦梗死組與對(duì)照組ABCA1 R219K基因型的比較

表5 ABCA1 R219K基因型對(duì)血脂和脂蛋白水平的影響

表6 ABCA1 R219K基因型與腦梗死OCSP分型比較

3 討論

腦梗死發(fā)病的基本病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊形成，動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素是血脂代謝失衡［12］和炎癥反應(yīng)［13，14］。目前公認(rèn)的脂蛋白滯留-應(yīng)答學(xué)說(shuō)［15］進(jìn)一步闡明了脂質(zhì)異常導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程，HDL-C被認(rèn)為是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白，其水平的高低反映了機(jī)體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力。HDL-C水平越高，動(dòng)脈血管壁等外周組織膽固醇蓄積的可能性越小，血管壁硬化程度越低。研究證實(shí)［6］ABCA1促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂(主要是卵磷脂)向貧脂或無(wú)脂的HDL-C前體載脂蛋白A1(ApoA1)轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)HDL-C的生成，從而在膽固醇代謝，清除組織內(nèi)過(guò)多膽固醇，抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面發(fā)揮決定性作用。Laloux等［16］的研究結(jié)果表明高甘油三酯血癥在腦梗死各個(gè)亞型中均普遍存在，Tobias等人進(jìn)行一項(xiàng)大型前瞻性隊(duì)列研究［17］表明腦梗死組HDL-C水平顯著低于對(duì)照組，研究發(fā)現(xiàn)白種人的ABCA1 R219K基因突變率超過(guò)40%，HDL-C水平升高明顯，從而減慢動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［9］。本研究資料表明腦梗死組患者血脂中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的水平高于對(duì)照組，對(duì)照組HDL-C水平高于腦梗死各OCSP分型組(本研究未收集到完全前循環(huán)梗死病例)，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，提示血脂異常者罹患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。HDL-C可能是腦梗死的保護(hù)性因素。

大多數(shù)研究［18～20］表明 ABCA1 R219K K 等位基因在降低甘油三酯的水平、升高HDL-C水平和產(chǎn)生有益的臨床血脂譜方面起重要作用，從而能減緩動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度，RR基因型血清中的有較高的甘油三酯水平和較低的HDL-C水平，Clee等［21］的研究表明K等位基因能降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的患病風(fēng)險(xiǎn)，K等位基因可作為動(dòng)脈粥樣硬化的單獨(dú)保護(hù)因素，然而Takagi等［8］的研究結(jié)果卻不支持以上結(jié)論，他們認(rèn)為R219K與血漿HDL-C水平及動(dòng)脈粥樣硬化的形成無(wú)明顯相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)KK型分子個(gè)體血脂水平均高于RK型和RR型，其中KK型分子個(gè)體的TG高于RR型，KK型分子個(gè)體的TC、HDL-C、ApoA-1高于 RK型，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而其他血脂水平比較各基因型間比較均無(wú)顯著性差異。

ABCA1 R219K基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究在國(guó)內(nèi)外不同人種中陸續(xù)有報(bào)道，但對(duì)于ABCA1 R219K與腦梗死關(guān)系的研究報(bào)導(dǎo)較少。多數(shù)研究認(rèn)為K等位基因能減少冠心病的發(fā)病，但有研究［22］卻表明R等位基因與冠心病獨(dú)立相關(guān)。有研究報(bào)道［23］K等位基因是腦梗死的獨(dú)立保護(hù)因素。然而一項(xiàng)針［24］對(duì)英國(guó)人群中ABCA1 R219K基因多態(tài)性與缺血性卒中的研究表明兩者無(wú)明顯相關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)腦梗死組RR型頻率高于對(duì)照組，但差異無(wú)顯著意義，腦梗死組與對(duì)照組ABCA1 R219K其余各基因型分布頻率比較，差異均不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ABCA1 R219K基因多態(tài)性與腦梗死無(wú)顯著相關(guān)性;根據(jù)OCSP分型，通過(guò)對(duì)腦梗死分層分析后發(fā)現(xiàn)，不同OCSP分型腦梗死的R219K基因型比較，差異無(wú)顯著意義，提示ABCA1 R219K基因多態(tài)性與腦梗死不同OCSP分型無(wú)顯著相關(guān)性。以上不同的研究結(jié)果可能與ABCA1 R219K的變異因種族、年齡、性別和環(huán)境不同而對(duì)腦梗死產(chǎn)生不同影響有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)因未收集到完全前循環(huán)梗死病例，分析原因考慮與該型患者較其他各型發(fā)病率少，且因病情過(guò)于危重采取就地醫(yī)治有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)并未嚴(yán)格匹配血壓、吸煙、飲食等混雜因素，因此有必要對(duì)以上混雜因素進(jìn)行更嚴(yán)格的配比，擴(kuò)大研究例數(shù)在不同人種中進(jìn)行研究，并對(duì)ABCA1基因其它單核苷酸多態(tài)性與腦梗死TOAST分型等其他腦梗死分型的關(guān)系做進(jìn)一步研究。

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