★ 王丁超 常銀江 蘇秀平 王靜 張韌 陳曉敏 (．河南省濮陽(yáng)市中醫(yī)院 濮陽(yáng)45700;．河南省濮陽(yáng)市人民醫(yī)院 濮陽(yáng)45700)

膿毒癥(sePsis)是指微生物入侵機(jī)體致感染后，所導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征。由膿毒癥導(dǎo)致的感染性休克、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ injury，MODS)，已成為臨床危重患者的重要死亡原因之一［1］。在膿毒癥多器官功能衰竭的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中炎癥反應(yīng)起著重要的作用，大量炎癥因子的釋放，使機(jī)體出現(xiàn)了一系列全身反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能衰竭，心臟是最常受累器官之一，心臟局部增加的炎癥因子是導(dǎo)致心功能障礙的重要因素［2，3］本實(shí)驗(yàn)以膿毒癥大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)觀察扶正敗毒顆粒對(duì)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞及心肌炎性因子IL－1、TNF－α的影響，以闡明其對(duì)膿毒癥的抗炎及心肌保護(hù)作用可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

青年SD大鼠154只，清潔級(jí)，雌雄各半，鼠齡3－4月，體質(zhì)量(300±50)g，由河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):scxk(豫)2009－0006)。

1.2 藥品、試劑與儀器

扶正敗毒顆粒，由濮陽(yáng)市中醫(yī)院中藥制劑室提供，批號(hào)為20090605;烏司他丁，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為S19990050。IL－1單克隆抗體(批號(hào):BA0990)及TNF－α單克隆抗體(批號(hào):BA0962)，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。PM－10AD型光學(xué)顯微鏡，Olympus optical Co．LTD產(chǎn)品;JA1203型電子天平，上海精科天平廠產(chǎn)品;XS－800i型自動(dòng)血液分析儀，日本希森美康公司產(chǎn)品。

1.3 分組與模型的建立

將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及扶正敗毒顆粒聯(lián)合烏司他丁聯(lián)合組(以下簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)，每組36只，另設(shè)假手術(shù)組10只。參考文獻(xiàn)［4，5］加以改良建立膿毒癥動(dòng)物模型。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠;待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規(guī)備皮、消毒;于頸外側(cè)下頜至心臟的中點(diǎn)作1個(gè)約1 cm的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸外靜脈;沿血管向近心端方向插入留置針約1 cm，將導(dǎo)管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導(dǎo)管慢慢置入達(dá)右心房，結(jié)扎固定，導(dǎo)管末端經(jīng)皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚;管內(nèi)注射125 U/mL肝素0．5 mL抗凝，插入置管針?lè)忾]導(dǎo)管;然后沿腹白線中段作3 cm切口，探查取出盲腸;用四號(hào)絲線距盲端1 cm處結(jié)扎，用12號(hào)針穿刺3孔，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。假手術(shù)組的處理分別在頸部及腹部做一切口，縫合，然后按各時(shí)間點(diǎn)取材。手術(shù)過(guò)程中保持大鼠肛溫(37．0±0．5)℃，保持室溫(26±1)℃。

1.4 給藥方法

造模后第1日，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、烏司他丁組用生理鹽水灌胃，扶正敗毒顆粒組、聯(lián)合組用扶正敗毒顆粒(36．8 mg/100g)灌胃(灌胃容積為1 mL/100g)，每日灌胃1次，連續(xù)7天，直至取材;此外，烏司他丁組、聯(lián)合組大鼠分別于造模后第1天腹腔內(nèi)注射烏司他丁(1萬(wàn)U/kg)，假手術(shù)組、模型對(duì)照組、扶正敗毒顆粒組用同等容積的生理鹽水腹腔注射，每天1次，連續(xù)7天，直至取材。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1．5．1 外周血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比率 取大鼠尾部靜脈血，用XS－800i自動(dòng)血液分析儀自動(dòng)分析計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞(×109·L－1)和中性粒細(xì)胞比率(%)。

1．5．2 臟器組織IL－1，TNF－α表達(dá) 檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)。免疫組化染色結(jié)果分析方法如下:光鏡下觀察，在400倍視野下，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕色為免疫組化陽(yáng)性。以光鏡觀察，用Image－Pro Plus 5．1專(zhuān)業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)采集圖像，并進(jìn)行半定量分析。每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)視野拍照，測(cè)定其平均吸光度(A)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值代表各細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

1．5．3 病理觀察 取心肌組織4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4～6μm厚的切片，常規(guī)脫蠟、脫水，蘇木素－伊紅(HE)染色，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組內(nèi)差異比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠外周血WBC計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率的影響

模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞比率較假手術(shù)組顯著升高(P＜0．01)。扶正敗毒顆粒組和烏司他丁組比模型組明顯降低(P＜0．05，P ﹤ 0．01)，以聯(lián)合 7d組的尤為顯著(P ＜0．01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率比較()

表1 各組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率比較()

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0．05，＊＊P＜0．01;與模型對(duì)照組比較:#P ＜0．05，##P ＜0．01;與扶正敗毒顆粒組比較:△P ＜0．05，△△P ＜0．01;與 2d組比較:＊P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與 3d組比較:▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 時(shí)間(天)動(dòng)物數(shù)(只)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109L－1)中性粒細(xì)胞比率(%)4．38 ±0．88 62．16 ±0．00模型對(duì)照組 2 6 12．07±1．27＊＊ 80．53±1．70＊＊3 6 15．88 ±1．78＊＊ 91．70 ±2．46＊＊7 6 14．58 ±1．57＊＊ 85．24 ±2．04＊＊▲扶正敗毒顆粒組 2 6 8．87 ±0．92 76．18 ±1．37 3 6 10．60 ±1．29## 82．35 ±1．69##7 6 9．17 ±1．25##＊＊▲▲ 73．21 ±2．26##＊＊▲▲烏司他丁組 2 6 8．25 ±0．77 77．06 ±1．60 3 6 9．33 ±1．11 80．39 ±1．45 7 6 6．75 ±1．76#△△＊＊▲▲ 72．86 ±2．27#△△＊＊▲▲聯(lián)合組 2 6 7．07 ±1．70 74．11 ±1．22#3 6 5．63 ±1．36## 70．26 ±1．94##7 6 4．98 ±0．98##△＊＊▲▲ 65．37 ±1．79##△＊＊▲▲假手術(shù)組6

2.2 心肌組織TNF－α、IL－1的表達(dá)變化

假手術(shù)組心肌組織少量TNF－α、IL－1陽(yáng)性表達(dá)。模型對(duì)照組心肌組織TNF－α、IL－1表達(dá)明顯高于假手術(shù)組 (P＜0．05或P＜0．01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組的3、7天及聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)TNF－α、IL－1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯降低(P＜0．05或P＜0．01)。各藥物組3天時(shí)TNF－α、IL－1陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)均較2天時(shí)減弱，7天時(shí)的表達(dá)均較3天時(shí)顯著減弱(P＜0．05或P＜0．01)，以聯(lián)合7天組尤為顯著(P＜0．01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織TNF－α、IL－1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)變化(IOD，光密度單位)()

表2 各組大鼠心肌組織TNF－α、IL－1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)變化(IOD，光密度單位)()

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0．05，＊＊P＜0．01;與模型對(duì)照組比較:#P ＜0．05，##P ＜0．01;與扶正敗毒顆粒組比較:△P ＜0．05，△△P ＜0．01;與 2d組比較:＊P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與 3d組比較:▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 時(shí)間(天)動(dòng)物數(shù)(只) 心肌組織TNF－α 心肌組織IL－1 2．46 ±1．12 1．97 ±1．35模型對(duì)照組 2 6 19．66 ±1．12 19．38 ±1．26 3 6 12．59 ± 2．3* 12．37 ± 1．22＊＊7 6 10．13 ±1．08＊＊▲ 10．38 ±2．38＊＊＊▲扶正敗毒顆粒組 2 6 12．77 ±1．12## 13．23 ±2．95 3 6 9．68 ± 1．54## 10．72 ±2．31#7 6 8．01 ±2．27##＊＊▲ 8．33 ±1．58#＊▲烏司他丁組 2 6 14．23 ±2．53# 15．63 ±2．63#3 6 10．93 ±1．46# 10．29 ±2．99＊7 6 9．56 ±1．41##＊▲ 9．11 ±1．46＊＊▲聯(lián)合組 2 6 7．49 ±1．77## 9．22 ±1．13##3 6 6．93 ± 1．88## 8．16 ±2．24##△7 6 5．88 ±1．66##△△＊＊▲▲ 6．24 ±2．32##假手術(shù)組6△△＊＊▲▲

2.3 病理改變

光鏡下假手術(shù)組心肌組織未見(jiàn)明顯的病理改變，心肌纖維排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，心肌細(xì)胞正常，心肌間質(zhì)無(wú)充血、水腫，未見(jiàn)炎性細(xì)胞。模型組大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌逐漸出現(xiàn)病理改變，心肌纖維斷裂，心肌組織排列紊亂，血管充血出血，心肌細(xì)胞間見(jiàn)成堆血細(xì)胞，心肌細(xì)胞腫脹或皺縮，胞核變形，心肌間質(zhì)充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，尤以3天組最明顯。實(shí)驗(yàn)藥物組心肌細(xì)胞損害較輕，心肌組織稍紊亂，可見(jiàn)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核未見(jiàn)明顯變化，較同時(shí)點(diǎn)模型組相比病理變化減輕，尤以聯(lián)合7天組最明顯。

3 討論

膿毒癥屬中醫(yī)學(xué)“傷寒”、“溫病”等范疇。由于邪毒入侵或各種創(chuàng)傷導(dǎo)致正邪交爭(zhēng)、正氣耗傷、邪毒阻滯而發(fā)病。正氣虧虛、濁毒內(nèi)蘊(yùn)、絡(luò)脈瘀滯是膿毒癥的主要病理機(jī)制之一。本病的病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以氣虛為主勢(shì)以緩，標(biāo)實(shí)則以濁毒(熱毒、瘀毒、濁毒)為主勢(shì)以急，虛、瘀、毒交互影響，形成惡性循環(huán)。故治療則以清熱解毒、降濁化瘀為主，兼顧益氣扶正。據(jù)此擬中藥復(fù)方扶正敗毒顆粒(由人參、生大黃、水牛角、生地黃、麥冬、玄參、石膏、知母、黃連、冰片等組成)治療。諸藥配伍，共奏解毒降濁、益氣化瘀之功效。本研究表明，經(jīng)過(guò)應(yīng)用扶正敗毒顆粒，膿毒癥大鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例降低，扶正敗毒顆粒對(duì)膿毒癥大鼠具有明顯的抗炎作用。

膿毒癥最主要的危害是引發(fā)多器官障礙綜合征(MODS)導(dǎo)致死亡，其本質(zhì)在于由眾多細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子參與的失控性炎癥反應(yīng)及炎癥反應(yīng)/抗炎反應(yīng)失衡［6］。炎癥瀑布效應(yīng)在誘導(dǎo)膿毒癥心肌損害中占主要地位。膿毒癥能夠引起TNF－α、IL－1等一系列炎癥介質(zhì)釋放。目前研究［7］認(rèn)為循環(huán)中以及心肌組織產(chǎn)生的炎癥因子如TNF－α、IL－1在膿毒癥心肌損害的發(fā)生發(fā)展中起重要作用:早發(fā)型心肌損害主要由TNF－α、IL－1引起。本研究顯示模型組大鼠心肌組織TNF－α、IL－1表達(dá)水平均較假手術(shù)組明顯上調(diào)，表明膿毒癥能刺激心肌細(xì)胞，激活炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)、重建炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)間的平衡是膿毒癥治療的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正敗毒顆粒能夠降低組織炎性因子TNF－α，IL－1表達(dá)水平，提示扶正敗毒顆粒通過(guò)降低心肌組織中炎性細(xì)胞因子TNF－α，IL－1含量，進(jìn)而減輕膿毒癥大鼠心肌組織損傷和降低死亡率。

［1］金惠銘．病理生理學(xué)［M］．第6版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:196．

［2］Ullrich R，Seherrer Crosbie M，Bloch KD，etal．Congenital deficiency of nitric oxkle synthase 2 Protects against endotoxin induced myocardial dysfunction in mice［J］．Circulation，2000，102(12):1 440 －1 446．．

［3］Baumgarten G，Knuefermann P，Nozald N，etal．In vivo expression of Proinflammatory mediators in the adult heart after endotoxin administration［J］．the role of toll like Fee Dtor J Infect Dis，2001，183(3):1 617－1 624．

［4］施新猷．現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］．北京:人民軍醫(yī)出版社，2000:298－335．

［5］Xiang D Z，Vverbeken K，Vanlommela T，etal．Intimal hyperplasia after long － term venous catheterization ［J］．Eur Surg Res，2000，32(4):236－245．

［6］SatSharma MD．Septic shock multiple organ failure and acute respiratory distress syndrome［J］．Medseape，2003，9:199 －209．

［7］Carlson DL，Willis MS，Whlte DJ，etal．Tumor necrosis factor induced caspase activationrnediates endotoxin－related cardiac dysfunction［J］．Crit Care Med，2005 33(5):1 021 －1 028．