★ 何國(guó)林 王羚酈 強(qiáng)皎 葉炳皇 林麗 張軍 (廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州510006)

風(fēng)濕寧膠囊是由當(dāng)歸、赤芍、秦艽等多種藥味組成的中藥復(fù)方制劑，有活血祛瘀止痛、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效。用于治療各類(lèi)關(guān)節(jié)軟組織損傷、骨折、脫位以及各類(lèi)關(guān)節(jié)痛等。本研究采用正交試驗(yàn)法，以芍藥苷和龍膽苦苷的綜合保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了風(fēng)濕寧膠囊的水提工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)建立基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

島津LC－20A高效液相色譜儀，ΜV檢測(cè)器，LC－20AT泵，SIL－20A自動(dòng)進(jìn)樣器，Labsolution色譜工作站;萬(wàn)分之一分析天平(Mettler Toledo CP225D);十萬(wàn)分之一分析天平(Mettler Toledo AB204－N)。芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110736－201035);龍膽苦苷對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)110330);色譜甲醇購(gòu)自Merck公司，水為自制超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［1］

以Kromasil C18柱為固定相，以甲醇－0．1%磷酸照下表1進(jìn)行梯度洗脫，芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，龍膽苦苷檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm，流速為 1．0mL/分。

表1 梯度洗脫表

2.2 專(zhuān)屬性考察

見(jiàn)圖1－8。

圖1 供試品溶液(230nm)

圖2 芍藥苷對(duì)照品溶液(230nm)

圖3 赤芍藥材溶液(230nm)

圖4 赤芍陰性對(duì)照液(230nm)

圖5 供試品溶液(254nm)

圖6 龍膽苦苷對(duì)照品溶液(254nm)

圖7 秦艽藥材溶液(254nm)

圖8 秦艽陰性對(duì)照液(254nm)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液(0．03216mg/mL)和龍膽苦苷對(duì)照品溶液(0．136mg/mL)2、4、8、12、16、20uL，注入液相色譜儀測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷回歸方程:y=1 589 528．20 x － 7438．59，R2=1．00。龍膽苦苷回歸方程為:y=1339014．71 x － 18 098．00，R2=1．00。結(jié)果表明:芍藥苷在 0．0644－0．644 μg 范圍內(nèi)，龍膽苦苷在 0．272 －2．72μg范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系。

2.4 風(fēng)濕寧膠囊提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)

2．4．1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在影響水提的因素中，煎煮次數(shù)，煎煮時(shí)間與水的用量較為重要，故選定煎煮次數(shù)，煎煮時(shí)間與水的用量作為考察因素，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以風(fēng)濕寧膠囊中的有效成分芍藥苷與龍膽苦苷的綜合保留率(芍藥苷和龍膽苦苷的權(quán)重系數(shù)均為0．5)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2．4．2 正交實(shí)驗(yàn) 按處方比例稱取全方藥材107．25g，照上述正交表?xiàng)l件進(jìn)行提取，各次提取液放冷，過(guò)濾，合并濾液，測(cè)定體積，備用。

2．4．3 供試品溶液制備 精密量取各正交藥液25mL，置50mL容量瓶中，邊振搖邊緩慢加入95%乙醇稀釋至刻度，靜置，取上清液，0．45um微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。分別以直觀分析和方差分析對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果分別見(jiàn)表4、5。分析結(jié)果表明，各因素對(duì)綜合保留率影響強(qiáng)弱依次為提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)、溶媒用量(C)。對(duì)綜合保留率影響最大的因素為提取次數(shù)(A)，其中水平3明顯優(yōu)于水平1，但與水平2差異不大，故將提取次數(shù)(A)的水平確定為2(提取兩次);提取時(shí)間(B)與溶媒用量(C)對(duì)綜合保留率影響較小，綜合考慮指標(biāo)成分提取率和臨床湯劑經(jīng)驗(yàn)，將提取時(shí)間的水平確定為水平2(1．5、1、1小時(shí))，將溶媒用量確定為水平3(12、10、10倍水)。因此篩選確定最佳提取條件為A2B2C3，即加水煎煮兩次，煎煮時(shí)間分別為1．5、1．0h，加水量分別為12、10 倍量水。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)綜合保留率直觀分析表

表5 正交試驗(yàn)綜合保留率方差分析表

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)所確定的最佳工藝條件的穩(wěn)定性，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。按優(yōu)選的最佳工藝制備三批樣品，參照2．3．3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，HPLC測(cè)定，計(jì)算綜合保留率。結(jié)果顯示，在所確定的最佳工藝條件下，芍藥苷和龍膽苦苷的綜合保留率均達(dá)90%以上，表明該提取工藝路線具有重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明，赤芍中的主要成分芍藥苷具有抗血栓、抗血小板聚集等作用［2］，秦艽中的龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝、促骨生長(zhǎng)、抗病毒抑菌等藥理活性［3］。二者作用接近風(fēng)濕寧膠囊功能主治所規(guī)定的治療范圍，故本實(shí)驗(yàn)以芍藥苷和龍膽苦苷的綜合保留率作為工藝篩選的考察指標(biāo)。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝，經(jīng)工藝的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)表明此法穩(wěn)定，質(zhì)量可控，為其工業(yè)化大生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．人民共和國(guó)藥典 一部［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010．

［2］劉超，王靜，楊軍．赤芍總苷活血化瘀作用的研究［J］．中藥材，2000，23(9):557 －560．

［3］蔡秋生，張志紅，高慧琴．秦艽藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27(6):55 －58．