鞏西玲

霍亂是由霍亂弧菌感染引發(fā)的一種流行廣泛的甲類傳染病。而霍亂弧菌是腸道傳染病霍亂的病原體，被感染者可表現為劇烈嘔吐、腹瀉、脫水，甚至導致死亡［1］。該病的發(fā)病率及病死率很高，曾在世界范圍內出現過多次大流行，對于霍亂的防治的關鍵在于對霍亂疫區(qū)的外環(huán)境標本進行及時監(jiān)測。對霍亂弧菌做出快速、精準的檢測是對霍亂預防、控制的主要方法。但其檢測一直是困擾微生物檢驗工作的一個難題，尤其是外環(huán)境水質和食品中霍亂弧菌的檢測，根據國內、外大量學者的研究，建立了許多有效的檢測方法，并已作為目前臨床的常用檢測手段廣泛應用。但霍亂弧菌在自然生存狀態(tài)下的帶菌量很少，常由于機制不清晰，同時，外環(huán)境標本摻雜大量其他菌群，從而導致霍亂弧菌的分離鑒定比較困難。常規(guī)培養(yǎng)法無法檢出霍亂弧菌，為了有效提高外環(huán)境中霍亂弧菌的檢出率，避免漏檢的發(fā)生，我們采用熒光定量PCR檢測方法，不僅提高了常規(guī)檢測方法的靈敏度，而且可以有效避免聚合酶鏈反應(PCR)方法帶來的假陽性?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 樣品來源 根據我市的霍亂病監(jiān)測規(guī)定，將批發(fā)市場，農貿市場，餐廳暫養(yǎng)，銷售的海、水產品共100份進行標本采集。

1.1.2 樣品種類 所采集的標本100份共分5大類:包括魚類 (20份):帶魚、黃瓜魚、金錢魚、鱔魚、鱸魚、鯽魚、鯧魚等;貝殼類 (20份):鮑魚、牡蠣、蟶子、鐵釘螺等;甲殼類 (20份):螃蟹、草蝦、河蝦等;蛙類 (20份):牛蛙、青蛙;水母類動物 (15份);甲魚 (5份)。

1.1.3 試劑 堿性胨水和四號瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋生物試劑有限公司的半成品粉劑，霍亂診斷血清購自中國藥品生物制品檢定所，所有產品都在有效期內。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)分離鑒定法 霍亂弧菌屬需氧或兼性厭氧菌，在普通培養(yǎng)基上生長良好，對營養(yǎng)的需求也不高，通常采用濃縮堿性胨水作為選擇性增菌培養(yǎng)基。具體方法:海產品20g加225ml堿性胨水;將pH值調至9.0，其增菌10h，取上層培養(yǎng)物接種到10ml堿性胨水中，做二次增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)8h，兩次均劃四號瓊脂平板進行分離培養(yǎng)，每個平板挑取略帶灰色，8～18個高度懷疑的圓潤透明如水滴樣可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平板。

1.2.2 PCR檢測法 檢測霍亂毒素基因ctxA和菌毛基因tcpA，取二代堿性胨水增菌液1.5ml，離心6min，棄上清液，加DNA裂解液，離心1min。取上清液做PCR模板，凝膠成儀觀察結果。出現308bp條帶為ctxA基因陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

選取100份海、水產品同時用兩種方法進行增菌培養(yǎng)，通過采用常規(guī)分離鑒定法，檢測到霍亂弧菌呈陽性6份 (6%)，通過PCR檢測法檢測出霍亂弧菌呈陽性9份 (9%)。兩組檢測方法比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 兩種檢測方法比較 (份)Table 1 Comparison of two detection methods

3 討論

霍亂弧菌的主要致病因子是霍亂腸毒素，霍亂腸毒素的檢出對霍亂弧菌的確定，是否能引起流行，具有較高的流行病學意義。截至目前為止，細菌培養(yǎng)、生化檢查以及血清學鑒定均仍然作為霍亂弧菌實驗室診斷的“黃金標準”［2］。海、水產品的樣品采集方法直接影響著霍亂弧菌的陽性率，在過去的幾年里，我們大多采用常規(guī)分離鑒定法對所采集的所有標本進行檢測，檢疫人員只要熟練掌握培養(yǎng)分離的條件和方法，就能從標本中篩離霍亂弧菌的病原菌。因此，該方法在過去的幾年里，一直被列入《國家標準》和《霍亂防治手冊》的推廣應用中。但伴隨著衛(wèi)生檢驗技術的不斷發(fā)展和進步，可以發(fā)現，該方法在進行增菌培養(yǎng)期間，由于分解代謝的產物不利霍亂弧菌的增殖，有的還會影響致病菌的生長，從而阻礙檢出結果的準確性?；魜y弧菌在堿性蛋白胨水中生長迅速，通常檢疫人員會將標本置于37℃的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6～8h后，在取上層培養(yǎng)物做弧菌分離。該菌在營養(yǎng)瓊脂和堿性瓊脂上可見，表面無色，呈圓形，色澤透明，質感光滑，濕潤，扁平或稍凸起，邊緣整齊。為了方便檢出，近年來，衛(wèi)生部在《霍亂防治手冊》中逐步推出海、水產品采用PCR檢測法。本文就對五大類海水產品霍亂弧菌污染狀況進行調查，通過對比發(fā)現，100份海、水產品同時用兩種方法進行增菌培養(yǎng)，兩種檢測方法的靈敏度雖然一致，但對于含菌量少的標本，在檢測上PCR檢測法更具優(yōu)勢。由于在不同的選擇性培養(yǎng)基上，霍亂弧菌會產生不同的菌落特征，因此，其培養(yǎng)基大多含有膽鹽、十二烷基磺酸鈉、亞硝酸鉀、慶大霉素、多黏菌素等抑菌劑。通過采用常規(guī)分離鑒定法，檢測到霍亂弧菌呈陽性6例，通過PCR檢測法檢測出霍亂弧菌呈陽性9例。即PCR檢測法比常規(guī)分離鑒定法在霍亂弧菌含量較少的標本上，其檢出率高，具有較好的敏感度和特異性。

PCR檢測方法可分為多重PCR與常規(guī)PCR兩種方法，所謂多重PCR檢測法，主要是指一次反應可檢測出多種基因，這樣不但大大節(jié)約了所需時間及成本，還有效提高了檢測效率。并能克服由于某種外因導致的檢測結果出現假陽性。并且，多重PCR可快速鑒定其菌屬是否為產毒株，還能從腹瀉患者的糞便標本中檢測到霍亂弧菌的腸道致病菌。從而有效提高感染性腹瀉病原學診斷的水平，為多種致病菌的快速診斷提供了新的方法。傳統(tǒng)的檢測方法由于所用周期長、工作量大，并且，受環(huán)境、培養(yǎng)條件以及主觀因素影響，不能滿足疾病預防和控制的需求，不利于實驗室的快速診斷。近年來，伴隨著檢測技術的不斷進步，檢測儀器的不斷更新，探針的設計顯得尤為精確，通過采用多通道熒光PCR儀的廣泛使用，多重熒光定量PCR技術也顯得尤為成熟，并且，具有高通量、低成本、高效率等多重優(yōu)勢，被研究學者廣泛應用于病毒、細菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為熱點檢測方法。建立了四重熒光定量PCR體系，從分子水平詳細闡述了霍亂的發(fā)生、發(fā)展、分布等規(guī)律，為霍亂弧菌的研究提供了更多的思路，有效降低了單重熒光定量PCR檢測毒力基因特異度不高造成結果假陽性的弊端，提高了檢測效率，降低了檢測成本，逐漸成為未來檢測技術的新的發(fā)展趨勢。并且，在進行標本采集時，需要注意樣品從采集、運送、保存直至檢測等環(huán)節(jié)均必須嚴格按照質量控制標準的要求。同時，按照參照《中國霍亂監(jiān)測方案》的技術規(guī)定進行操作，每份樣品均需要采集足夠的數量，確保樣品的代表性及有效性。值得注意的是，從1820年至今，我國的霍亂流行，都是由國外傳人引起的，我國不是霍亂的疫源地圈。

有關部門必須加強海、水產品的監(jiān)測，在進行海、水產品霍亂弧菌的檢測中，由于霍亂弧菌菌型復雜，尤其是甲魚，一旦受到霍亂弧菌污染，霍亂弧菌可能在其體內存活時間較長，并污染水體。同時，可能將霍亂弧菌傳染給消費者，導致疾病。通過本文研究發(fā)現，魚類、貝殼類、甲殼類、蛙類、水母類以及甲魚均檢出毒力基因為產毒株，具有流行性和致病性的可能。因此，做好霍亂預防工作，海、水產品的衛(wèi)生狀況對食品衛(wèi)生和消費健康關系密切，加強飲食衛(wèi)生監(jiān)督管理，同時，加強全民健康教育，改善居民的不良飲食習慣，提醒人們盡量少生食海、水產品以防霍亂弧菌的傳播流行，提高霍亂防治知識和意識，切斷傳播途徑，防止霍亂疫情爆發(fā)。對保障我國國際旅行人員健康，保障正常國際交往和國際貿易均有非常積極的意義。綜上所述，兩種方法雖然各有優(yōu)勢，但PCR檢測法用于霍亂弧菌的檢測，能最大限度降低漏檢的可能性，對臨床檢驗及衛(wèi)生檢測有較高的指導意義。

1 吳以華，徐景野，李岳良，等.微量培養(yǎng)板不同保存時間對霍亂弧菌培養(yǎng)效果的觀察［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，27(4):629－630.

2 姚美琳，周發(fā)珍，王榕峰，等.2003—2007年廈門市海倉區(qū)外環(huán)境巾霍亂弧菌監(jiān)測結果分析 ［J］.預防醫(yī)學論壇，2008，14(10):924－925.