郭曉培，李艾芳，張寶旭，2，王 旗，2

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，北京 100191;2.國家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點(diǎn)研究室，北京100191)

白鮮皮是蕓香科植物白鮮(Dictamnus dasycarpus)的根皮，為常用的傳統(tǒng)中藥。白鮮堿(dictamnine)是白鮮皮的主要成分之一，又稱白鮮胺或白蘚堿，屬呋喃喹啉類生物堿，在白鮮皮中含量約0.1%[1]。白鮮堿能抑制血小板聚集、松弛血管并降低血壓等，具有抗菌、抗病毒和治療皮膚濕疹和皮膚瘙癢的作用[2－4]。2008 年，Jang 等[5]報(bào)道，韓國農(nóng)村地區(qū)患者連續(xù)服用白鮮堿水煎劑每日5～6次，連續(xù)數(shù)日，出現(xiàn)急性肝炎，提示白鮮皮具有潛在急性肝毒性。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，ig給予ICR小鼠白鮮皮水煎劑，小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和堿性磷酸酶活性及總膽紅素明顯升高，并具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系;較高劑量白鮮皮給藥48 h后，小鼠肝組織出現(xiàn)大面積中心性壞死。白鮮皮中主要成分之一的白鮮堿單獨(dú)給藥達(dá)到一定劑量，也可致ICR小鼠發(fā)生急性肝損傷，ALT和LDH活性與對照組相比明顯升高(待發(fā)表)。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白鮮堿具有潛在的肝毒性，可能是白鮮皮中的毒性成分。HepG2細(xì)胞來源于人肝胚細(xì)胞瘤，其所含的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有同源性，其分化程度較高，并且保留了較完整且活性穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化代謝酶，是研究藥物肝毒性常用的細(xì)胞模型之一[6－7]。本研究用HepG2細(xì)胞研究白鮮堿的肝毒性作用及其毒性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、主要試劑和儀器

HepG2細(xì)胞，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。白鮮堿，中國藥品生物制品檢定所(批號(hào):200301，純度≥98%);陽性對照鹽酸胺碘酮(amiodarone，AD)和鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride，PPH)，天津一方科技有限公司;羰基氰化氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)，北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。Triton X-100和羅丹明123，Sigma公司;MEM培養(yǎng)基，北京清大天一生物科技有限公司;胰蛋白酶、MTT和 HEPES，Amresco公司;ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、LDH、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyltranspeptidase，GGT)活性測定試劑盒，南京建成生物工程有限公司。Multiskan MK3酶標(biāo)儀，美國 Thermo公司;TE2000-S倒置顯微鏡和DXM1200F數(shù)字?jǐn)z像機(jī)，日本Nikon公司;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 MTT法測定細(xì)胞存活率

將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 kU·L－1、含 Earle 鹽和L-谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，24～48 h換液，每2～3 d傳代1次。用無水乙醇溶解白鮮堿，再用不含血清的MEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞(3～5)×105L－1接種于96 孔培養(yǎng)板上，每孔200 μl。待12 h細(xì)胞完全貼壁以后，吸去上清液，分別加入不同濃度的白鮮堿 200 μl，其終濃度分別為 25，50，100，200，300，400，500 和 800 μmol·L－1，正常對照組為細(xì)胞加入等體積無血清培養(yǎng)基，溶劑對照組用等體積的1%無水乙醇代替白鮮堿，作用24 h。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。用MTT法測定細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=加藥組A490nm/正常對照組A490nm×100%。

1.3 LDH釋放率測定

細(xì)胞處理同1.2，白鮮堿的終濃度分別為2.5，5，12.5，25，50，100 和 200 μmol·L－1，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取細(xì)胞上清液 20 μl，然后每孔加入 2%Triton X-100 溶液 200 μl，裂解細(xì)胞 1 h，吸取每孔裂解液20 μl，按照試劑盒說明書的方法分別測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量和細(xì)胞裂解液中LDH的含量，LDH釋放率(%)=細(xì)胞上清液中LDH含量/(細(xì)胞上清液LDH含量+細(xì)胞裂解液中LDH含量)×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞(3～5)×107L－1接種于6孔培養(yǎng)板上，每孔1500 μl。待12 h細(xì)胞完全貼壁后，吸去上清液，分別加入白鮮堿1500 μl，終濃度分別為25，50，100和200 μmol·L－1，另設(shè)正常對照和溶劑對照組。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT，AST，GST和GGT活性測定

細(xì)胞培養(yǎng)同1.2。白鮮堿的終濃度分別為25，50，100 和 200 μmol·L－1，每個(gè)濃度 4 個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測定 ALT，AST，GST和 GGT 活性的陽性對照分別為 AD 25 μmol·L－1，AD 25 μmol·L－1，Triton X-10080 μmol·L－1和 PPH 125 μmol·L－1。培養(yǎng)時(shí)間分別為 24 h;24 h;4 和24 h及4，24和48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取上清液，按照ALT，AST，GST和GGT試劑盒方法進(jìn)行處理后，用酶標(biāo)儀分別在510 nm(ALT，AST和 GST)或410 nm(GGT)處測定每孔A值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT，AST，GST 和GGT含量。

1.6 線粒體膜電位的測定

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，消化后種于共焦小皿中，細(xì)胞密度為 1 ×105L－1，每孔 500 μl，待12 h細(xì)胞完全貼壁后，吸出培養(yǎng)液，加入白鮮堿，終濃度分別為25，50，100 和200 μmol·L－1，正常對照和溶劑對照組同1.2，作用HepG2細(xì)胞24 h，陽性對照為 CCCP 20 μmol·L－1作用 30 min，PBS 清洗2次，加入終濃度為2 mg·L－1的羅丹明123負(fù)載液500 μl，孵育20～30 min后，PBS 清洗2次覆蓋貼壁細(xì)胞，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察線粒體膜電位的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白鮮堿對HepG2細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與正常對照和溶劑對照組相比，不同濃度的白鮮堿與HepG2細(xì)胞作用24 h，細(xì)胞存活率隨著濃度的增加而降低(r=0.965，P＜0.05)，800 μmol·L－1可使細(xì)胞存活率降至 10% 以下。用Origin8.0軟件擬合計(jì)算 IC50為(283±27)μmol·L－1。

2.2 白鮮堿對HepG2細(xì)胞膜的損傷

由表1 看出，白鮮堿在 12.5～50 μmol·L－1時(shí)引起HepG2細(xì)胞膜損傷，LDH釋放率較溶劑對照組顯著升高(P＜0.01)，但隨著白鮮堿濃度增加，LDH釋放率反而降低，與溶劑對照組無顯著差異。

Fig.1 Effect of dictamnine on survival of HepG2 cells.HepG2 cells were incubated with dictamnine 25，50，100，200，300，400，500 and 800 μmol·L －1for 24 h.The cell viability was examined by MTT assay.NC:normal control;SC:solvent(1%ethanol)control.Cell viability(%)=A490 nmof drug group/A490 nm of NC group.±s，n=5.

Tab.1 Effect of dictamnine on lactate dehydrogenase(LDH)release in HepG2 cells

2.3 白鮮堿對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示，HepG2細(xì)胞形狀無規(guī)則，處于增長期時(shí)，細(xì)胞增殖明顯，呈片狀生長。白鮮堿作用HepG2細(xì)胞24 h，與正常對照和溶劑對照組相比，細(xì)胞數(shù)目明顯減少;白鮮堿濃度為100和200 μmo·lL－1時(shí)，細(xì)胞死亡漂浮的數(shù)量更多，細(xì)胞皺縮，散開，脫落。

2.4 白鮮堿對HepG2細(xì)胞ALT和AST活性的影響

Fig.2 Effect of dictamnine on morphological changes of HepG2 cells(×100).See Tab.1 for the cell treatment.The morphological changes of HepG2 cells were observed under a contrast microscope.A:normal control;B:1%ethanol;C －F:dictamnine 25，50，100 and 200 μmol·L－1，respectively.

Tab.2 Effect of dictamnine on alanine transaminase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)activity in HepG2 cells

由表2看出，白鮮堿與HepG2細(xì)胞作用24 h，與溶劑對照組相比，陽性對照AD 25 μmol·L－1組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性明顯升高(P＜0.05);白鮮堿 100 和200 μmol·L－1組 ALT 活性顯著升高(P＜0.05)，具有濃度依賴關(guān)系(r=0.995，P＜0.05);白鮮堿 25～200 μmol·L－1均使AST活性升高，且具有濃度依賴性(r=0.996，P＜0.05)。

2.5 白鮮堿對HepG2細(xì)胞GST活性的影響

如表3 所示，陽性對照 Triton X-10080 μmol·L－1與HepG2細(xì)胞作用4和24 h，與其對應(yīng)的溶劑對照(0.4%DMSO)組相比，GST活性明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。白鮮堿 25 和 50 μmol·L－1與HepG2細(xì)胞作用4 h，GST活性與其對應(yīng)的溶劑對照(1%乙醇)組相比無明顯變化;100 和200 μmol·L－1時(shí)，GST活性明顯升高(P＜0.01);白鮮堿50～200 μmo·lL－1與HepG2細(xì)胞作用24 h，GST活性均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。

Tab.3 Effect of dictamnine on glutathione S-transferase(GST)activity in HepG2 cells

2.6 白鮮堿對HepG2細(xì)胞GGT活性的影響

由表4可見，與1%乙醇溶劑對照組相比，陽性對照PPH和白鮮堿與HepG2細(xì)胞分別作用4和24 h，GGT活性均無明顯變化。與HepG2細(xì)胞作用48 h，與溶劑對照組相比，PPH和白鮮堿200 μmol·L－1組GGT活性明顯升高(P＜0.05)。

Tab.4 Effect of dictamnine on glutamyl transferase(GGT)activity in HepG2 cells

2.7 白鮮堿對HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

由圖3和表5所示，白鮮堿與HepG2細(xì)胞作用24 h，羅丹明123的熒光強(qiáng)度隨著白鮮堿濃度的增加而逐漸下降，呈一定的濃度依賴關(guān)系(r=0.978，P＜0.05)，表明白鮮堿濃度越大，線粒體膜電位下降越多，線粒體膜損傷越嚴(yán)重。

Fig.3 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane potential in HepG2 cells determined with rhodamine 123(OI:×40;NA=1.25).See Tab.1 for the cell treatment.OI:oil immersion;NA:numerical aperture.A:normal control;B:1%ethanolo;C:carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone(CCCP)20 μmol·L－1for 30 min;D－G:dictamnine 25，50，100 and 200 μmol·L－1for 24 h.

Tab.5 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane potential(ΔΨ)in HepG2 cells

3 討論

近年含有白鮮皮的中藥復(fù)方如青黛丸、消銀片、克銀丸、白癜風(fēng)膠囊、濕毒清膠囊和痔血膠囊等均有造成不同程度肝損傷的報(bào)道，引起各方面的關(guān)注。本研究觀察白鮮皮的主要成分之一白鮮堿的肝細(xì)胞毒性。MTT結(jié)果表明，白鮮堿對HepG2細(xì)胞作用24 h，IC50值為(283±27)μmol·L－1，此結(jié)果與Schempp等[2]報(bào)道白鮮堿對人Jurkat細(xì)胞光毒性作用的 IC50為 245 μmol·L－1相近;但郭娜等[3]報(bào)道，白鮮堿對人脾細(xì)胞毒性作用的IC50≥1024 mg·L－1(約5.14 mmol·L－1);由此表明白鮮堿對不同類型細(xì)胞的毒性不同。LDH是反映外源性化合物引起細(xì)胞膜損傷的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，白鮮堿在12.5～50 μmol·L－1時(shí)使 HepG2 細(xì)胞 LDH 釋放率增加，高于50 μmol·L－1時(shí)細(xì)胞的LDH釋放率與溶劑對照組相比無明顯差異，這可能與細(xì)胞形態(tài)皺縮和數(shù)目減少有關(guān)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變也發(fā)現(xiàn)，隨著白鮮堿濃度的增加，細(xì)胞皺縮，脫落，細(xì)胞數(shù)目迅速減少，漂浮的死亡細(xì)胞越來越多。

MTT實(shí)驗(yàn)檢測的是線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)的活性，SDH 是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，為反映線粒體活性的一種標(biāo)志酶。白鮮堿對HepG2細(xì)胞存活的影響呈濃度依賴關(guān)系，提示HepG2細(xì)胞線粒體活性隨白鮮堿濃度的增大而降低，這與本研究檢測的線粒體膜電位隨白鮮堿濃度的增大而下降趨勢是一致的。肝是體內(nèi)含酶最豐富的器官，也是酶代謝的主要場所，當(dāng)肝受損傷時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加，肝細(xì)胞內(nèi)的酶外漏，導(dǎo)致血清中酶的活性增高。ALT存在于細(xì)胞質(zhì)，AST主要存在于線粒體。已有研究表明，AD對HepG2細(xì)胞的毒性與其引起ALT和AST活性變化有關(guān)[8－9]。因此本研究選用AD作為檢測HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的陽性對照。本研究結(jié)果表明，白鮮堿較高濃度(100 和 200 μmol·L－1)能引起HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT活性升高，而白鮮堿低濃度25 μmol·L－1即導(dǎo)致 AST 活性升高，并呈濃度依賴關(guān)系，且AST活性升高幅度比ALT更明顯。此結(jié)果表明，白鮮堿可引起線粒體中的AST外泄，伴隨細(xì)胞質(zhì)中的ALT漏出。

HepG2細(xì)胞的特點(diǎn)為主要表達(dá)Ⅱ相代謝酶，GST是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化重要的Ⅱ相代謝酶之一。GST亦稱為膽紅素結(jié)合蛋白，由于其分子質(zhì)量較ALT小，易穿過受損的細(xì)胞膜溢出胞外，在肝細(xì)胞膜受損時(shí)其升高先于ALT的升高，反映細(xì)胞毒性更加敏感。GGT在肝中主要在肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生，而且對肝毒性的特異性高。因此，本研究深入探討白鮮堿對 HepG2細(xì)胞 GST和 GGT活性的影響。Gerets等[10]報(bào)道，一定劑量的Triton X 100能引起HepG2細(xì)胞中α-GST活性升高。也有研究報(bào)道，一定濃度的AD作用于細(xì)胞后，肝細(xì)胞受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，GGT活性特異性地升高[11]。本研究中不同濃度的白鮮堿分別作用4和24 h，較高濃度白鮮堿100 和200 μmol·L－1可使 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)液中的GST活性升高。作用時(shí)間延長至48 h，可使細(xì)胞培養(yǎng)液中GGT活性升高。該結(jié)果提示，白鮮堿在達(dá)到一定濃度和時(shí)間后，可造成HepG2細(xì)胞中GST和GGT的釋放，GST活性的敏感性更高，作用短時(shí)間即受到影響。

綜上所述，白鮮堿對HepG2細(xì)胞具有毒性，白鮮堿的毒性作用涉及線粒體活性的變化和細(xì)胞膜損傷，伴隨多種酶活性的改變。

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