張 波，龍 隆，王莉莉，劉克良，宮澤輝

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所1.新藥評定研究室，2.藥物化學(xué)研究室，北京 100850)

穿琥寧系穿心蓮提取物穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后所得化合物，是以穿心蓮內(nèi)酯為母核在其側(cè)鏈的羥基位點(diǎn)進(jìn)行了酯化、脫水、成鹽而成。穿琥寧具有消炎退腫、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌和抗病毒的作用，在臨床上常用于治療外感高熱和急性感染性疾病等[1－2]。以往研究主要集中在探討原型藥物穿心蓮內(nèi)酯的抗炎作用機(jī)制，提示其抗炎機(jī)制主要與阻斷NF－κB寡核苷酸與核酸蛋白的鏈接，進(jìn)而降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧化酶 2(cyclooxygenase 2，COX－2)表達(dá)有關(guān)[3]。以往研究認(rèn)為，穿心蓮內(nèi)酯通過抑制NF－κB活性，降低炎性蛋白iNOS和COX－2的表達(dá)及NO和PGE2的產(chǎn)生是穿心蓮抗炎機(jī)制之一[4]。NF－κB是與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)分子[5－6]，在單核巨噬細(xì)胞膜上能激動NF－κB通路的受體主要有白細(xì)胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)，腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，抑制其中任何一種受體都可以抑制NF－κB的活性。目前尚無研究表明穿心蓮內(nèi)酯是通過膜受體產(chǎn)生效應(yīng)，還是直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)起作用，有關(guān)穿琥寧的研究更少。本研究采用高靈敏度的IN Cell Analyzer 2000活細(xì)胞成像系統(tǒng)，在特異性表達(dá)IL－1β或TNF受體的組成性表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白偶聯(lián) NK－κBP65(enhanced green fluorescent protein－NF－κBP65)融合蛋白的CHO細(xì)胞模型上，評價穿琥寧對IL－1β和 TNF－α誘導(dǎo)的NF－κBP65核轉(zhuǎn)位的抑制作用;在特異性表達(dá)LPS受體的組成性表達(dá)EGFP偶聯(lián)促分裂原活化蛋白激酶 APk2(EGFP－mitogen activated protein kinase APk2，EGFP－MAPK－APk2)融合蛋白的BHK細(xì)胞模型上，評價穿琥寧對 LPS誘導(dǎo)的P38MAPK下游分子 MAPK－APk2核轉(zhuǎn)位的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

穿琥寧(粉末)，成都一平科技發(fā)展公司。組成性表達(dá)EGFP－NF－κBP65融合蛋白的CHO細(xì)胞購自美國Thermo公司;組成性表達(dá) EGFP－MAPKAPk2融合蛋白的BHK細(xì)胞購自美國GE公司;RAW264.7細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞)購自協(xié)和細(xì)胞資源庫;小鼠抗血紅素加氧酶－1(heme oxygenase－1，HO－1)抗體、兔抗iNOS抗體和兔抗COX－2抗體均購自香港Abcam公司;小鼠抗β肌動蛋白抗體購自Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體(二抗)均購自北京中杉金橋公司;殺稻瘟素(blasticidin)購自上海希美生物公司;IL－1β和TNF－α購自美國 PEPROTECH公司，kBα抑制劑(kBα inhibitor，IκBα)特異性抑制劑 Ro106－9920購自美國Merck公司;LPS和鋅原卟啉(zinc protoporphyrian，ZnPP)(HO－1 活性抑制劑)購自美國Sigma公司;WST－8細(xì)胞計數(shù)試劑盒購自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司;一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司;前列腺素E2(prostaglandine E2，PGE2)ELISA試劑盒購自泰澤瑞達(dá)(北京)科技有限公司;胎牛血清、G418、F12培養(yǎng)液和 DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;染色液購自美國Invitrogen公司。IN Cell Analyzer 2000活細(xì)胞成像系統(tǒng)，美國GE公司;GENios pro酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司;垂直電泳槽，美國 Bio－Rad公司;DYY－8C 型電泳儀，北京六一儀器廠;Thermo Froma 311型水套式CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司;凝膠成像儀，美國Kodak公司。

1.2 激動劑和化合物的配制

激動劑IL－1β用含0.1%胎牛血清的PBS配成10 mg·L－1母液，用分析培養(yǎng)液配成20 μg·L－1(4 ×，終濃度 5 μg·L－1)工作液;IκBα 抑制劑 Ro106－9920 用 DMSO 配成 25 mmol·L－1母液，分析培養(yǎng)液配成200 μmo·lL－1(4×，終濃度50 μmol·L－1);激動劑 TNF－α用含0.1%胎牛血清的 PBS配成100 mg·L－1母液，用分析培養(yǎng)液配成 40 μg·L－1(4 ×，終濃度10 μg·L－1);激動劑LPS 用PBS 配成1 g·L－1母液，用分析培養(yǎng)液配制成4 mg·L－1(4 ×，終濃度1 mg·L－1)工作液;穿琥寧用1%NaHCO2水溶液配成40 mmo·lL－1母液，用分析培養(yǎng)液配成4×工作液，選用3，10，30 和100 μmol·L－1連續(xù)4 個濃度。工作液臨用前配制，20 min內(nèi)使用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

組成性表達(dá) EGFP－NF－κBP65 融合蛋白的CHO 細(xì)胞培養(yǎng)于含 G4180.5 g·L－1、殺稻瘟素5 mg·L－1和10% 胎牛血清的F12培養(yǎng)液中;組成性表達(dá)EGFP－MAPK－APk2融合蛋白 BHK 細(xì)胞，培養(yǎng)于含G4180.5 g·L－1和10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液中;RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。上述細(xì)胞培養(yǎng)條件均為37℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞存活率測定

按照WST－8細(xì)胞計數(shù)試劑盒說明書測定細(xì)胞存活率。RAW264.7細(xì)胞懸液(1×108L－1)按每孔100 μl加入96孔板中(邊緣孔用無菌水填充)，培養(yǎng)過夜。每孔加入含穿琥寧終濃度分別為3，10，30和100 μmol·L－1的培養(yǎng)液10 μl，細(xì)胞對照和空白對照(不加細(xì)胞)組加等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)7復(fù)孔，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入WST－8試劑10 μl，在培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(A藥物－A空白對照)/(A細(xì)胞對照－A空白對照)× 100%

1.5 抑制IL－1β 和TNF－α 誘導(dǎo)NF－κBP65 核轉(zhuǎn)位分析

將組成性表達(dá) EGFP－NF－κBP65融合蛋白的CHO 細(xì)胞按每孔100 μl(含1.5×104細(xì)胞)接種于預(yù)鋪細(xì)胞黏附劑的96孔黑色孔底透光的細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)18～24 h。每孔細(xì)胞用100 μl分析培養(yǎng)液洗 3 次，換 100 μl分析培養(yǎng)液，分細(xì)胞對照組、IL－1β 5 μg·L－1激動劑組、Ro106－9920(陽 性 對 照)50 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1組及穿琥寧 3，10，30 和 100 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1組，每組設(shè)3 復(fù)孔。陽性對照和穿琥寧組CHO細(xì)胞先與 Ro106－9920或穿琥寧作用60 min，再加入 IL－1β 作用 40 min，測定穿琥寧對IL－1β誘導(dǎo)的NF－κBP65核轉(zhuǎn)位的影響。CHO 細(xì)胞分細(xì)胞對照組、TNF－α 10 μg·L－1激動劑組及穿琥寧 3，10，30 和 100 μmol·L－1+TNF－α 10 μg·L－1組，每組設(shè)3復(fù)孔。穿琥寧組CHO細(xì)胞先與穿琥寧作用60 min，再加入 TNF－α作用60 min，測定穿琥寧對 TNF－α誘導(dǎo)的 NF－κBP65核轉(zhuǎn)位的影響。每孔細(xì)胞用染色液 200 μl洗 3 次，并留在200 μl染色液中室溫染色1 h。細(xì)胞在 IN Cell Analyzer 2000活細(xì)胞成像系統(tǒng)上檢測細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核熒光強(qiáng)度，每孔5個視野連續(xù)拍照。使用GE公司IN Cell Analyzer 1000 Nuclear Trafficking Analysis Module軟件分析細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度比值，表示報告基因核轉(zhuǎn)位，并計算穿琥寧抑制核轉(zhuǎn)位的活性。穿琥寧抑制率(%)=(激動劑處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位－穿琥寧處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位)/(激動劑處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位－對照組細(xì)胞核轉(zhuǎn)位)×100%。

1.6 抑制LPS誘導(dǎo)MAPK－APk2核轉(zhuǎn)位分析

將組成性表達(dá)EGFP－MAPK－APk2融合蛋白的BHK 細(xì)胞按每孔100 μl(含1.5 ×104個細(xì)胞)接種于預(yù)鋪細(xì)胞黏附劑的96孔黑色孔底透光的細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)18～24 h。每孔細(xì)胞用100 μl分析培養(yǎng)液洗3 次，換100 μl分析培養(yǎng)液，分細(xì)胞對照組、LPS 1 mg·L－1激動劑組和穿琥寧 3，10，30 和 100 μmol·L－1+LPS 1 mg·L－1組，每組設(shè)3復(fù)孔。穿琥寧組BHK細(xì)胞先與穿琥寧作用60 min，再加入LPS作用30 min，測定穿琥寧對LPS誘導(dǎo)的MAPK－APk2核轉(zhuǎn)位的影響。每孔細(xì)胞用染色液200 μl洗 3 次，并留在200 μl染色液中室溫染色1 h。同1.5測定并計算穿琥寧抑制核轉(zhuǎn)位的活性。穿琥寧抑制率(%)=(穿琥寧處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位－激動劑處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位)/(對照組細(xì)胞核轉(zhuǎn)位－激動劑處理細(xì)胞核轉(zhuǎn)位)×100%。

1.7 Western 印跡法測定 HO－1，iNOS 和 COX－2蛋白表達(dá)

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含穿琥寧終濃度分別為3，10，30 和100 μmol·L－1培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，用冷PBS清洗3次，加入細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞提取細(xì)胞全蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)濃度，所提取的蛋白質(zhì)用于檢測HO－1的表達(dá)。同樣將 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分細(xì)胞對照組、IL－1β 5 μg·L－1組、IL－1β 5 μg·L－1+ 穿琥寧 100 μmol·L－1組和 IL－1β 5 μg·L－1+ 穿琥寧 100 μmol·L－1+ZnPP 5 μg·L－1組，分別處理細(xì)胞 6 h，提取總蛋白質(zhì)用于檢測COX－2蛋白表達(dá);分別處理12 h，提取總蛋白質(zhì)用于檢測iNOS蛋白表達(dá)。取蛋白質(zhì)40 μg上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，分別用抗 HO－1抗體(1∶2000)，COX－2 抗體 (1 ∶1000)，iNOS 抗 體(1∶1000)或β肌動蛋白抗體(1∶5000)一抗孵育過夜，洗膜，加入二抗孵育1 h，洗膜，發(fā)光液孵育，凝膠成像系統(tǒng)通過Quantity one軟件分析各條帶的積分吸光度(integrated absorbance，IA)。目的蛋白的相對表達(dá)水平用 IA目的蛋白/IAβ肌動蛋白比值表示。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)液中PGE2和NO含量測定

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分細(xì)胞對照組、IL－1β 5 μg·L－1組、IL－1β 5 μg·L－1+穿琥寧 100 μmol·L－1組，IL－1β 5 μg·L－1+ 穿琥寧100 μmol·L－1+ZnPP 5 μg·L－1組，分別處理細(xì)胞6 h，取培養(yǎng)液，按試劑盒說明書測定PGE2含量;分別處理12 h，取培養(yǎng)液，按試劑盒說明書測定NO含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 穿琥寧的細(xì)胞毒性作用

穿琥 寧 3，10，30 和 100 μmol·L－1處 理RAW264.7細(xì)胞24 h，與細(xì)胞對照組比較，A450nm均未發(fā)生明顯變化，細(xì)胞存活率均在100%以上，表明穿琥寧小于100 μmol·L－1無明顯細(xì)胞毒性(表1)。

Tab.1 Effect of Chuanhuning on viability of RAW264.7 cells

2.2 穿琥寧對IL－1β 誘導(dǎo)NF－κBP65核轉(zhuǎn)位的影響

IL－1β 受體激動劑 IL－1β 能誘導(dǎo) NF－κBP65 熒光蛋白從胞漿向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，IκBα特異性抑制劑Ro106－9920能完全阻斷其核轉(zhuǎn)位效應(yīng)，其抑制率為100%(圖 1)。經(jīng)計算，穿琥寧 3，10，30 和100 μmol·L－1對 IL－1β 誘導(dǎo) NF－κBP65 核轉(zhuǎn)位無抑制作用，抑制 率 分 別 為 (9.3±7.8)%，(7.1±8.3)%，(4.7±8.3)%和(－4.5±8.6)%(n=3)，提示穿琥寧的抗炎鎮(zhèn)痛作用可能不是IL－1β受體所介導(dǎo)的。

2.3 穿琥寧對TNF－α誘導(dǎo)NF－κBP65核轉(zhuǎn)位的影響

TNF－α 受體激動劑 TNF－α 能誘導(dǎo) NF－κBP65熒光蛋白從胞漿向核內(nèi)轉(zhuǎn)位(圖2)。穿琥寧3，10，30 和 100 μmol·L－1對 TNF－α 誘導(dǎo) NF－κBP65核轉(zhuǎn)位有較弱的抑制作用，經(jīng)計算其抑制率分別為(19.9±7.2)%，(18.1±8.5)%，(15.9±7.6)%和(16.2±8.8)%(n=3)，提示穿琥寧的主要抗炎鎮(zhèn)痛作用可能不是由TNF－α受體介導(dǎo)的。

Fig.1 Effect of Chuanhuning on nuclear transfer of NF－κBP65 induced by interlukin－1β(IL－1β)in CHO cells with enhanced green fluorescent protein(EGFP)－NF－κBP65(×20).The green fluorescence was detected by IN Cell Analyzer 2000 live cell imaging system.A:control group，CHO cells were incubated in medium for 100 min，GFP was distributed in cytoplasm;B:IL－1β 5 μg·L －1group，CHO cells were incubated in medium for 60 min，then with IL－1β for 40 min，NF－κBP65 with GFP was transferred to the nucleus as shown by arrow;C:Ro106－992050 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1group，CHO cells were incubated with Ro106－9920 for 60 min，then coincubated with IL－1β for 40 min，nuclear transfer effect of GFP was blocked;D:Chuanhuning 100 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1group，CHO cells were incubated with Chuanhuning for 60 min，then coincubated with IL－1β for 40 min，nuclear transfer effect of NF－κBP65 could not be inhibited and GFP could still be observed in the nucleus as shown by arrow.

Fig.2 Effect of Chuanhuning on nuclear transfer of NF－κBP65 induced by tumor necrosis factor－α (TNF－α)in CHO cells with EGFP－NF－κBP65(×20).The green fluorescence was detected by IN Cell Analyzer 2000 live cell imaging system.A:control group，CHO cells were incubated in medium for 120 min，GFP was distributed in the cytoplasm and almost invisible in nucleus;B:TNF－α 10 μg·L－1group，CHO cells were incubated in medium for 60 min，then with TNF－α for 60 min，NF－κBP65 with GFP was transferred to the nucleus as shown by arrow;C:Chuanhuning 100 μmol·L －1+TNF－α 10 μg·L －1group，CHO cells were incubated with Chuanhuning for 60 min，then coincubated with TNF－α for 60 min，nuclear transfer effect of NF－κBP65 could not be inhibited and GFP could still be observed in the nucleus as shown by arrow.

2.4 穿琥寧對LPS誘導(dǎo)MAPK－APk2核轉(zhuǎn)位的影響

LPS受體激動劑LPS能誘導(dǎo)MAPK－APk2熒光蛋白從細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位(圖3)。穿琥寧3，10，30 和 100 μmol·L－1對 LPS 誘導(dǎo) MAPK－APk2核轉(zhuǎn)位無抑制作用，經(jīng)計算其抑制率分別為(－6.1±4.8)%，(－5.7±4.7)%，(－ 5.0±4.8)% 和(－4.8±5.8)%(n=3)，提示穿琥寧的抗炎鎮(zhèn)痛作用可能不是由LPS受體介導(dǎo)的。

Fig.3 Effect of Chuanhuning on nuclear transfer of mitogen activated protein kinase APk2(MAPK－APk2)induced by lipopolysaccharides(LPS)in BHK cells with EGFP－MAPK－APk2(×20).The green fluorescence was detected by IN Cell Analyzer 2000 live cell imaging system.A:control group，BHK cells were incubated in medium for 90 min，GFP gathered in the nucleus without agonist;B:LPS 1 mg·L －1group，BHK cells were incubated in medium for 60 min，then with LPS for 30 min，MAPK－APk2 with GFP was transferred to the cytoplasm under stimulating with LPS as shown by arrow;C:Chuanhuning 100 μmol·L －1+LPS 1 mg·L －1group，CHO cells were incubated with Chuanuning for 60 min，then coincubated with LPS for 30 min，nuclear transfer effect of MAPK－APk2 could not be inhibited as shown by arrow.

2.5 穿琥寧對RAW264.7細(xì)胞HO－1蛋白表達(dá)的影響

如圖4 所示，穿琥寧10，30 和100 μmol·L－1分別處理RAW264.7細(xì)胞4 h，能夠誘導(dǎo)HO－1蛋白的表達(dá)(P＜0.01);穿琥寧3 μmol·L－1作用不明顯。

Fig.4 Effect of Chuanhuning on heme oxygenase－1(HO－1)expression in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with Chuanhuning for 4 h.The expression of HO－1 was determined with Western blotting(A)and expressed as IAHO－1/IAβ－Actin(B).IA:integrated absorbance.Lane 1:cell control;lane 2－5:Chuanhuning 3，10，30 and 100 μmol·L －1，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 穿琥寧對 RAW264.7細(xì)胞 COX－2表達(dá)和PGE2產(chǎn)生的影響

Fig.5 Effect of Chuanhuning on cyclooxygenase 2(COX－2)expression stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +zinc protoporphyria(ZnPP)for 6 h，respectively.The expression of COX－2 was determined with Western blotting(A)and expressed as IACOX－2/IAβ－Actin(B).1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L －1;3:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1;4:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1+ZnPP 5 μmol·L －1 .±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β 5 μg·L －1group;△△P＜0.01，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

如圖5 所示，在 IL－1β 刺激下，RAW264.7 細(xì)胞COX－2表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，穿琥寧能明顯抑制IL－1β的刺激作用(P＜0.01)，HO－1特異性拮抗劑ZnPP能部分逆轉(zhuǎn)穿琥寧對IL－1β誘導(dǎo)COX－2表達(dá)的抑制作用(P＜0.01)。同樣，如圖6所示，穿琥寧抑制 IL－1β 誘導(dǎo) PGE2的產(chǎn)生(P＜0.01)，ZnPP也部分逆轉(zhuǎn)穿琥寧對IL－1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的抑制作用(P＜0.05)。

Fig.6 Effect of Chuanhuning on production of prostaglanddins E2(PGE2)stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +ZnPP，respectively，for 6 h.The PGE2concentration was determined with PGE2kit.1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L －1;3:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1;4:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1+ZnPP 5 μmo·lL－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β group;△P＜0.05，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

2.7 穿琥寧對RAW264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)和NO產(chǎn)生的作用

Fig.7 Effect of Chuanhuning on inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +ZnPP，respectively，for 12 h.The expression of iNOS was determined with Western blotting(A)and expressed as IAiNOS/IAβ－Actin(B).1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L－1;3:Chuanhuning 100 μmo·lL－1+IL－1β 5 μg·L－1;4:Chuanhuning 100 μmo·lL－1+IL－1β 5 μg·L－1+ZnPP 5 μmol·L－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β group;△△P＜0.01，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

如圖7 所示，在 IL－1β 刺激下，RAW264.7 細(xì)胞iNOS表達(dá)明顯高于細(xì)胞對照組(P＜0.01)，穿琥寧作用后其表達(dá)下降(P＜0.01)，HO－1特異性拮抗劑ZnPP部分逆轉(zhuǎn)穿琥寧對IL－1β iNOS表達(dá)的抑制作用(P＜0.01)。同樣，如圖8所示，穿琥寧抑制IL－1β誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生(P＜0.01)，ZnPP也部分逆轉(zhuǎn)穿琥寧對IL－1β誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的抑制作用(P＜0.01)。

Fig.8 Effect of Chuanhuning on production of nitric oxide(NO)stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +ZnPP，respectively，for 12 h.The NO concentration was determined with kit.1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L －1;3:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1;4:Chuanhuning 100 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1+ZnPP 5 μmo·lL－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β group;△△P＜0.01，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，穿琥寧對CHO細(xì)胞IL－1β受體和BHK細(xì)胞LPS受體無抑制作用，對CHO細(xì)胞TNF－α受體僅具有較弱的抑制活性(抑制強(qiáng)度20%)，且無明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系。但是，在RAW264.7細(xì)胞模型上，穿琥寧能顯著抑制 IL－1β刺激產(chǎn)生的炎性蛋白iNOS和COX－2的表達(dá)及NO和PGE2生成，提示NF－κB通路可能不是穿琥寧抗炎作用的主要機(jī)制。

炎癥是組織對損傷因子產(chǎn)生的復(fù)雜防御反應(yīng)。刺激單核巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥因子的信號通路，除了NF－κB這條經(jīng)典的抗炎通路外，還存在其他的抗炎通路。目前研究較多的是HO－1，HO－1是血紅素代謝的限速酶和起始酶，能將血紅素代謝成一氧化碳、膽綠素和游離的鐵離子[7]，這些代謝產(chǎn)物都是重要的生物效應(yīng)分子，在抗氧化、抗炎和抗增殖中發(fā)揮著重要的作用[8－10]。據(jù)報道，穿心蓮內(nèi)酯能夠誘導(dǎo) HO－1 的高表達(dá)[11]。本研究在 RAW264.7 細(xì)胞模型上，發(fā)現(xiàn)穿琥寧也能夠誘導(dǎo)HO－1表達(dá)增加，抑制由IL－1β刺激產(chǎn)生的iNOS和COX－2高表達(dá)及NO和PGE2生成;HO－1特異性拮抗劑ZnPP能顯著阻斷穿琥寧的作用，部分逆轉(zhuǎn)穿琥寧對炎性物質(zhì)釋放的抑制作用，提示穿琥寧能促進(jìn)HO－1蛋白表達(dá)，其抗炎作用可能主要是通過促進(jìn)HO－1蛋白表達(dá)，繼而抑制 iNOS，COX－2，NO 和 PGE2等炎性物質(zhì)的生成和釋放，最終發(fā)揮抗炎作用。綜上所述，NF－κB信號通路可能不是穿琥寧發(fā)揮抗炎作用的主要通路，其抗炎作用可能是通過HO－1信號通路發(fā)揮作用。HO－1信號通路與NF－κB信號通路之間相互調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究為闡明穿琥寧的抗炎作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為 HO－1信號系統(tǒng)與NF－κB通路可能存在相互調(diào)節(jié)的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Long P，F(xiàn)ang WM，Xiang L.Clinical application of the Chuanhuning injection[J].Acta Chin Med Pharmacol(中醫(yī)藥學(xué)報)，2001，29:52－54.

[2]Na ZL，Qing SH，Qin Z，Qiong PS.The ADR analysis of Chuanhuning for 45 cases[J].China Pharmacy(中國藥房)，2004，15:300－301.

[3]Xia YF， Ye BQ， Li YD， Wang JG，He XJ，Lin X，et al.Andrographolide attenuates inflammation by inhibition of NF－kappaB activation through covalent modification of reduced cysteine 62 of p50[J].J Immunol，2004，173(6):4207－4217.

[4]Hidalgo MA，Romero A，F(xiàn)igueroa J，Cortés P，Concha II，Hancke JL，et al.Andrographolide interferes with binding of nuclear factor－kappaB to DNA in HL－60－derived neutrophilic cells[J].Br J Pharmacol，2005，144(5):680－686.

[5]García－Mediavilla V，Crespo I，Collado PS，Esteller A，Sánchez－Campos S，Tu?ón MJ，et al.The anti－inflammatory flavones quercetin and kaempferol cause inhibition of inducible nitric oxide synthase，cyclooxygenase－2 and reactive C－protein，and down－regulation of the nuclear factor kappaB pathway in Chang Liver cells[J].Eur J Pharmacol，2007，557(2－3):221－229.

[6]Konson A，Mahajna JA，Danon A，Rimon G，Agbaria R.The involvement of nuclear factor－kappa B in cyclooxygenase－2 overexpression in murine colon cancer cells transduced with herpes simplex virus thymidine kinase gene[J].Cancer Gene Ther，2006，13(12):1093－1104.

[7]Chung HT，Pae HO，Cha YN.Role of heme oxygenase－1 in vascular disease[J].Curr Pharm Des，2008，14(5):422－428.

[8]Kikuchi G， Yoshida T， Noguchi M. Heme oxygenase and heme degradation[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，338(1):558－567.

[9]Gueler F， Park JK， Rong S， Kirsch T，Lindschau C，Zheng W，et al.Statins attenuate ischemia－reperfusion injury by inducing heme oxygenase－1 in infiltrating macrophages[J].Am J Pathol，2007，170(4):1192－1199.

[10]Abraham NG，Kappas A.Pharmacological and clinical aspects of heme oxygenase[J].Pharmacol Rev，2008，60(1):79－127.

[11]Yu AL，Lu CY，Wang TS，Tsai CW，Liu KL，Cheng YP，et al.Induction of heme oxygenase 1 and inhibition of tumor necrosis factor alpha－induced intercellular adhesion molecule expression by andrographolide in EA.hy926 cells[J].J Agric Food Chem，2010，58(13):7641－7648.