邢富強(qiáng)，曾禮漳，孫愛珍，邢 達(dá)

(華南師范大學(xué)激光生命科學(xué)研究所暨教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

0 引言

環(huán)境脅迫經(jīng)常會(huì)影響到植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育過程，同時(shí)植物也會(huì)對(duì)環(huán)境影響做出相應(yīng)的反應(yīng)，這就是植物與環(huán)境的相互作用。植物在與病原菌的互作過程中，含無毒基因(Avr)的病菌侵染植物往往會(huì)出現(xiàn)超敏反應(yīng) (hypersensitive response，HR)，超敏性細(xì)胞死亡是植物抗病性的一種常見反應(yīng)，植物通過這種方式可以抵御外源病原菌入侵，抑制病原菌在植物體的進(jìn)一步擴(kuò)散［1，2］。病原激發(fā)子 (elicitor)本身是一類來自于病原物，能夠作用于植物并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生HR的物質(zhì)，作為病原菌的可致病性的毒素成分，可以應(yīng)用于病原菌脅迫對(duì)植物體致病機(jī)理的研究中［3-5］。伏馬毒素B1(FB1)是由串珠鐮刀菌分泌的效應(yīng)因子，作為病原激發(fā)子能夠引起玉米等大量作物的病害減產(chǎn)［6］。有報(bào)道指出，F(xiàn)B1對(duì)人、畜也是一種潛在的致癌物，動(dòng)物試驗(yàn)和流行病學(xué)資料已表明，F(xiàn)B1能夠損害肝腎功能，引起馬腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫等［7］，現(xiàn)已引起世界范圍的廣泛注意。目前，研究發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌，串珠鐮刀菌等多種病原菌都可以引起植物出現(xiàn)光依賴性的HR程序性細(xì)胞死亡［8，9］，葉綠體作為植物吸收和轉(zhuǎn)化光能的細(xì)胞器，推測(cè)葉綠體在HR過程中發(fā)揮著重要的作用?；钚匝?ROS)爆發(fā)通常被認(rèn)為是植物與病原菌的互作過程中植物對(duì)病原菌的早期反應(yīng)之一［10］。目前有研究認(rèn)為ROS產(chǎn)生的作用主要有:首先ROS具有抵抗微生物對(duì)植物入侵的作用，ROS在殺死入侵微生物的同時(shí)能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)和繼續(xù)擴(kuò)散。此外，ROS在病原菌入侵或者植物受到逆境脅迫時(shí)還能夠作為信號(hào)分子，通過信號(hào)級(jí)聯(lián)放大誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)基因的表達(dá)以及生成次生代謝產(chǎn)物，進(jìn)而提高植物的抗病能力。但ROS是否參與FB1誘發(fā)的光依賴性的HR過程以及ROS的具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

本文利用葉綠素分子的天然探針特性以及使用H2DCFDA，綠色熒光蛋白(GFP)等光學(xué)分子標(biāo)記，采用光譜分析和熒光檢測(cè)技術(shù)手段，通過比較固定熒光產(chǎn)量(Fo)，最大熒光產(chǎn)量(Fm)，最大光量子產(chǎn)量 (Fv/Fm)，實(shí)際量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)，研究了伏馬毒素B1侵染對(duì)擬南芥葉片光合效率的影響。同時(shí)，植物葉綠體基質(zhì)定位標(biāo)記GFP后，在體無損觀測(cè)了葉綠體基質(zhì)蛋白在FB1處理下的形態(tài)生理變化。GFP是從一種從水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)綠色熒光的蛋白。可用于特定蛋白和各種細(xì)胞器的標(biāo)記定位，如線粒體、葉綠體、細(xì)胞骨架、細(xì)胞核等等［11］。GFP標(biāo)記細(xì)胞器后，可以被用來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+、pH、電勢(shì)、金屬酶活力以及細(xì)胞器的形態(tài)與運(yùn)動(dòng)［12］。借助激光共聚焦顯微鏡觀察，初步研究了FB1誘導(dǎo)的擬南芥葉片光依賴性HR早期引起細(xì)胞死亡的早期信號(hào)事件，檢測(cè)了ROS信號(hào)分子的產(chǎn)生及亞細(xì)胞定位，細(xì)胞器形態(tài)和功能的改變，從而為今后深入開展植物光依賴性HR的機(jī)制研究提供一定的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 哥倫比亞野生型擬南芥 (ecotype Columbia，Col)種子先在4℃春化處理2-3天，然后在人工氣候培養(yǎng)箱 (E7/2，Winnipeg，Canada)土培，光周期為 16 h/8 h(光/暗)，晝夜溫度:23℃/21℃ (晝/夜)。CT-GFP轉(zhuǎn)基因種子 (Maureen R.Hanson教授惠贈(zèng))。生長(zhǎng)三周至四周的擬南芥植株用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 伏馬毒素B1購于上海Sigma，熒光染料 H2DCF-DA(Eugene，OR，USA)工作濃度為5μmol/L，其它普通化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)。激光共聚焦顯微鏡 (LCSM 510/confoCor2，Zeiss，Germany)，調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xImaging-PAM Chlorophyll Fluorometer(Walz，Effeltrich，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 FB1侵染 選取生長(zhǎng)至四周并且狀態(tài)良好的擬南芥葉片用于實(shí)驗(yàn)。以等量的含0.01%甲醇的水作為空白對(duì)照，10μmol/L FB1樣品 (用0.01%甲醇溶解)噴灑后的植株放在人工氣候培養(yǎng)箱中保持濕度培養(yǎng)。

1.2.2 原生質(zhì)體的提取 方法參考張玲瑞等［13］，生長(zhǎng)三至四周齡的擬南芥葉片，先在無光條件下適應(yīng)2 d以消除光對(duì)植物的影響。用鋒利的刀片將葉片切割成0.5-1.0 mm的小條。置于2.5mL酶解液(1%-1.5%的纖維素酶 R10，0.2%-0.4% 的離析酶R10，0.8 mmol/L 甘露醇，500 mmol/L KCI，100 mmol/L MES，100 mmol/L CaCl2)中，抽真空處理 0.5 h 后，放置在黑暗條件下酶解3 h。用孔徑為35-75μm的尼龍網(wǎng)過濾，100 g離心力下離心3 min，棄上清，將下層原生質(zhì)體小心的重新懸浮于W5(500 mmol/L KCI，100 mmol/L MES，500 mmol/L CaCI2，l mmol/L NaCl)溶液中，懸浮濃度為2×105個(gè)/mL。

1.2.3 葉綠素?zé)晒獬上裼^測(cè)與分析 采用調(diào)制熒光成像系統(tǒng)Imaging-PAM Chlorophyll Fluorometer(Walz，Effeltrich，Germany)測(cè)定不同處理下的擬南芥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)。測(cè)定前，葉片先暗適應(yīng)20 min，每隔 0.5 h 測(cè)定一次，得到 Fo，F(xiàn)m，F(xiàn)v/Fm，Y(Ⅱ)。測(cè)量光頻率為 1 Hz，強(qiáng)度 0.5μmol/m2·s，光化光強(qiáng)為 165μmol/m2·s，持續(xù) 10 min;飽和脈沖強(qiáng)度為 2500μmol/m2·s，持續(xù) 0.8 s。

1.2.4 激光共聚焦顯微觀察 激光共聚焦顯微鏡(LSM 510 META，Carl-Zeiss，Jena，Germany)，實(shí)驗(yàn)用488 nm氬離子激光作為激發(fā)光源，GFP自發(fā)熒光和DCF熒光以500～550 nm的帶通濾光片探測(cè)，葉綠體自發(fā)熒光650 nm的長(zhǎng)通濾光片探測(cè)。物鏡為40倍的油鏡。圖像及其數(shù)據(jù)使用軟件Zeiss Rel 3.2系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 伏馬毒素B1對(duì)葉片光化學(xué)效率的影響

一般情況下，10μmol/L FB1處理擬南芥葉片需要4天才能出現(xiàn)肉眼可見的HR癥狀。本文使用FB1處理2天的葉片檢測(cè)了光化學(xué)效率。從圖1看出，光暗條件顯著影響了葉綠素?zé)晒飧鱾€(gè)參數(shù)的變化。Fo代表不參與PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分，是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量，在逆境條件下會(huì)升高。Fm是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量，可反映通過 PSⅡ的電子傳遞情況，F(xiàn)m的下降表明植株的最大熒光效率下降。Fv/Fm是PS II潛在最大光合效率，即PS II最大量子產(chǎn)量，在逆境脅迫下一般會(huì)下降。Y(Ⅱ)反映了PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)的光能轉(zhuǎn)換效率，該參數(shù)在正常條件下變化極小，不受物種和生長(zhǎng)條件的影響，在逆境條件下會(huì)明顯下降。在本文實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)o的增加代表 PSⅡ反應(yīng)中心出現(xiàn)可逆的失活或不易逆轉(zhuǎn)的破壞，說明經(jīng)FB1侵染過的擬南芥葉片，其PSⅡ反應(yīng)中心受到了損傷。Y(Ⅱ)的減少表明PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)光能轉(zhuǎn)換效率降低，導(dǎo)致光合電子傳遞紊亂，葉片的光合作用被顯著抑制，光合效率降低。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了光參與促進(jìn)FB1對(duì)葉片光合系統(tǒng)的損傷和光合作用的抑制過程，進(jìn)而推動(dòng)葉片HR的形成。

2.2 光依賴的ROS產(chǎn)生及其亞細(xì)胞定位

活性氧 (ROS)主要包括超氧陰離子，過氧化氫等。在病原菌與植物的互作過程中，ROS爆發(fā)通常被認(rèn)為是植物對(duì)病原菌刺激的初期反應(yīng)事件，從而對(duì)植物細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。因此，我們從擬南芥葉片中提取出原生質(zhì)體，觀察了200 nmol/L FB1處理后細(xì)胞ROS的產(chǎn)生情況，ROS的產(chǎn)生可以用熒光探針H2DCFDA監(jiān)測(cè)［14］。先將熒光探針H2DCFDA于原生質(zhì)體預(yù)孵育20 min，然后加FB1在光暗條件下共聚焦觀察ROS的產(chǎn)生 (圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在處理30 min內(nèi)，F(xiàn)B1+Light處理組產(chǎn)生ROS的細(xì)胞逐漸增多，而暗處理和對(duì)照組則基本不變化或只有微小的上升，說明FB1誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生是光依賴性的 (圖2A)。通過單細(xì)胞定位觀察，DCF熒光和葉綠體自發(fā)熒光區(qū)域是重疊的，說明ROS產(chǎn)生主要來自于植物細(xì)胞的葉綠體 (圖2B)。以上實(shí)驗(yàn)表明FB1誘導(dǎo)的擬南芥葉片原生質(zhì)體ROS產(chǎn)生是光依賴性的，并且主要來源于細(xì)胞的葉綠體中。

2.3 ROS參與促進(jìn)葉綠體降解

由圖3可見，對(duì)照組在40 h時(shí)，GFP標(biāo)記的葉綠體基質(zhì)蛋白基本無變化，而FB1處理組中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GFP熒光呈現(xiàn)出了明顯下降的趨勢(shì)，說明FB1處理能明顯增加了葉綠體GFP標(biāo)記蛋白的降解過程。由于ROS在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞PCD過程中起到了重要的作用，因此我們推測(cè)其降解機(jī)制可能是由于ROS的積累作為FB1處理作為刺激的初期反應(yīng)事件而引起的。因此，我們使用了ROS清除劑過氧化氫酶(CAT)和抗氧化劑抗壞血酸 (AsA)觀察ROS產(chǎn)生對(duì)葉綠體降解的影響。CAT的主要作用是將過氧化氫分解代謝［15］，清除植物體內(nèi)的 ROS，抗壞血酸則是起到抗氧化作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B1+CAT和FB1+AsA處理組的GFP熒光下降速度減緩，說明CAT和AsA預(yù)處理后能明顯抑制了FB1誘導(dǎo)的葉綠體蛋白降解過程，從而維持了葉綠體維持正常的形態(tài)和生理功能。在FB1誘導(dǎo)的植物HR中，ROS能誘導(dǎo)植物細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞程序性死亡和葉綠體降解，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加會(huì)加快細(xì)胞死亡，進(jìn)一步證實(shí)了ROS的產(chǎn)生是導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡的重要因素。

圖1 A.光暗條件對(duì)FB1誘導(dǎo)的擬南芥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的照片;B.定量測(cè)定光暗條件下FB1誘導(dǎo)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化Fig.1 A.Chlorophyll fluorescence image of Arabidopsis leaves after infected by FB1 in the presence or absence of light.The false colour code depicted at the bottom of each image ranged from 0.000(black)to 1.000(purple);B.Quantitative analyses of changes in various chlorophyll fluorescence parameters induced by FB1 in the absence or presence of light.Each value was the mean ± S.D.of five independent leaves

圖2 A.FB1誘導(dǎo)的擬南芥細(xì)胞光依賴性的ROS產(chǎn)生;(標(biāo)尺=100μm);B.DCF熒光的亞細(xì)胞定位。(標(biāo)尺 =20μm)Fig.2 A.FB1-induced ROS production is light-dependent in Arabidopsis cells;(Scale bars=100μm)B.The subcellular localization of DCF fluorescence.(Scale bars=20μm)

3 討論

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)在研究植物葉片的光合作用過程中對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面有在體、無損、快速的特點(diǎn)［16-19］。本文的葉綠素?zé)晒獬上駲z測(cè)結(jié)果表明在光參與FB1誘導(dǎo)HR過程的前期，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fo升高，而Fv/Fm，Y(Ⅱ)以及Fm則明顯降低，說明了在光參與下FB1抑制了葉綠體的光合效能，對(duì)光合系統(tǒng)的損傷最為嚴(yán)重，所以植物光依賴性的HR過程與光合系統(tǒng)受損具有明顯的相關(guān)性，為研究病原激發(fā)子誘導(dǎo)光依賴性HR的機(jī)制開拓了新的思路。

圖3 FB1誘導(dǎo)的擬南芥葉片葉綠體產(chǎn)生的ROS對(duì)GFP標(biāo)記的葉綠體蛋白的影響。(標(biāo)尺=50μm)Fig.3 Effects of chloroplastic ROS induced by FB1on the chloroplastic GFP protein in Arabidopsis leaves.(Scale bars=50μm)

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B1促進(jìn)了光依賴性ROS的產(chǎn)生，并且主要來源于葉綠體(圖2)，作為病原激發(fā)子FB1誘導(dǎo)的前期事件，這種光依賴性產(chǎn)生的信號(hào)分子作為啟動(dòng)超敏性細(xì)胞程序性死亡的前期信號(hào)可能是在葉綠體光合電子傳遞鏈?zhǔn)軗p后過剩能量引發(fā)電子泄露產(chǎn)生。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出 (圖1，2)，F(xiàn)B1侵染葉片后導(dǎo)致的ROS迸發(fā)，與光合系統(tǒng)受損也有明顯的相關(guān)性。在植物受逆境脅迫情況下，一定劑量的ROS產(chǎn)生可以作為信號(hào)分子起到信號(hào)傳遞功能［20］。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) (圖3)，F(xiàn)B1明顯促進(jìn)了GFP標(biāo)記的葉綠體基質(zhì)蛋白的降解，而過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸(AsA)的預(yù)處理則抑制了這一過程。由于GFP相對(duì)較小，只有238個(gè)氨基酸，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能，通過葉綠體帶GFP蛋白的葉片實(shí)時(shí)觀測(cè)FB1脅迫對(duì)葉綠體形態(tài)變化的影響，加深了我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)一些過程的了解，推動(dòng)了葉綠體凋亡途徑的研究。

本研究使用光學(xué)分子成像技術(shù)，為揭示病原激發(fā)子誘導(dǎo)的植物光依賴性的HR的機(jī)理，尤其是從分子水平闡明植物在病原激發(fā)子誘導(dǎo)下HR的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，將有助于進(jìn)一步了解植物在受周圍環(huán)境脅迫下的各種生理現(xiàn)象的本質(zhì)，對(duì)指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)意義。

［1］LAM E，KATO N，LAWTON M.Programmed cell death，mitochondria and the plant hypersensitive response［J］.Nature，2001，411:848-853

［2］HEATH M C.Hypersensitive response-related death［J］.Plant Mol Biol，2000，44:321-334.

［3］BOURQUE S D A，HAMMOUDI V，BLANC S，et al.Type-2 histone deacetylases as new regulators of elicitor-induced cell death in plants［J］.New Phytol，2011，192:127-139.

［4］MATSUMURA H，NIRASAWA S，KIBA A，et al.Overexpression of Bax inhibitor suppresses the fungal elicitor-induced cell death in rice(Oryza sativa L.)cells［J］.Plant J，2003，33:425-437.

［5］KIM K S，MIN J-Y，DICKMAN M B.Oxalic acid is an elicitor of plant programmed cell death during Sclerotinia sclerotiorum disease development［J］.Mol Plant Microbe In，2008，21:605-612.

［6］SORIANO J M，GONZALEZ L，CATALA A I.Mechanism of action of sphingolipids and their metabolites in the toxicity of fumonisin B1［J］.Prog Lipid Res，2005，44:345-356.

［7］SHARMA R P，DUGYALA R R，VOSS K A.Demonstration of in-situ apoptosis in mouse liver and kidney after short-term repeated exposure to fumonisin B1［J］.J Comp Pathol，1997，117(4):371-381.

［8］GRIEBEL T，ZEIER J.Light regulation and daytime dependency of inducible plant defences in Arabidopsis:phytochrome signaling controls systemic acquired resistance rather than local defence［J］.Plant Physiol，2008，147:790-801.

［9］ASAI T，STONE J M，HEARD J E，et al.Fumonisin B1-induced cell death in Arabidopsis protoplasts requires jasmonate-，ethylene-，and salicylate-dependent signaling pathways［J］.Plant Cell，2000，12:1823-1836.

［10］LAMB C，DIXON R A.The oxidative burst in plant disease resistance［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1997，48:251-275.

［11］HANSON M R，KOHLER R H.GFP imaging:methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants［J］.J Exp Bot，2001，52:529-539.

［12］IZUMI M，WADA S，MAKINO A，et al.The autophagic degradation of chloroplasts via Rubisco-containing bodies is specifically linked to leaf carbon status but not nitrogen status in Arabidopsis［J］.Plant Physiol，2010，154:1196-1209.

［13］ZHANG L R，XING D.Methyl jasmonate induced production of reactive oxygen species and alterations in mitochondrial dynamics that precede photosynthetic dysfunction and subsequent cell death［J］.Plant Cell Physiol，2008，49:1092-1111.

［14］JAKUBOWSKI W，BARTOSZ G.2，7-Dichlorofluorescein oxidation and reactive oxygen species:what does it measure［J］.Cell Biology International，2000，24:757-760.

［15］BAGNYUKOVA T V，VASYLKIV O Y，STOREY K B，et al.Catalase inhibition by aminotriazole induces oxidative stress in goldfish brain［J］.Brain Res，2005，1052:180-186.

［16］ZHANG W N，CHEN W L.Role of salicylic acid in alleviating photochemical damage and autophagic cell death induction of cadmium stress in Arabidopsis thaliana［J］.Photochem Photobiol Sci，2011，10:947-955.

［17］KB BONFIG，U SCHREIBER，A GABLER，et al.Infection with virulent and avirulent P.syringae strains differentially affects photosynthesis and sinkmetabolismin Arabidopsis leaves［J］.Planta，2006，225:1-12.

［18］CHAERLE L，VAN DER STRAETEN D.Imaging techniques and the early detection of plant stress［J］.Trends Plant Sci，2000，5:495-500.

［19］ROHá?EK K.Chlorophyll fluorescence parameters:the definitions，photosynthetic meaning，and mutual relationships［J］.Photosynthetica，2002，40:13-29.

［20］WANG P C，DU Y Y，LI Y，et al.Hydrogen peroxide-mediated activation of MAP Kinase 6 modulates nitric oxide biosynthesis and signal transduction in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2010，22:2981-2998.