詹求強(qiáng)，劉 靜，趙宇翔，張 欣

(華南師范大學(xué)華南先進(jìn)光電子研究院光及電磁波研究中心，廣東廣州 510006)

0 前言

隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，光學(xué)生物成像技術(shù)在其中發(fā)揮的作用越來越重要，而熒光成像因?yàn)槠涓叻直媛省㈧`敏、快速的特點(diǎn)得到了非常廣泛的研究和應(yīng)用。目前的熒光標(biāo)記物主要是有機(jī)染料熒光團(tuán)、量子點(diǎn)(quantum dot，QD)、金屬納米顆粒、上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticles，UCNPs)、碳納米顆粒等。這其中，有機(jī)染料熒光團(tuán)使用的最早也最廣泛，但其光穩(wěn)定性差，不能長時(shí)間連續(xù)觀察，且吸收和發(fā)光譜線寬;半導(dǎo)體量子點(diǎn)光穩(wěn)定性好，輻射譜線窄，但其可能存在的生物毒性和化學(xué)不穩(wěn)定性使其不能進(jìn)一步在生物熒光成像領(lǐng)域得到應(yīng)用。

UCNPs作為一種近期快速發(fā)展的熱門熒光標(biāo)記物，在某些方面比有機(jī)染料熒光團(tuán)和量子點(diǎn)有明顯的優(yōu)勢(shì)。圖1給出了UCNPs和QD這兩種材料在生物應(yīng)用上論文數(shù)量的比較，兩條曲線有著相似的走向，可以看出UCNPs的熱門程度不亞于QD，上轉(zhuǎn)換文章數(shù)量的快速增長正說明了這一材料的巨大潛力。UCNPs主要指摻雜了稀土(rare earth，RE)元素后能夠受兩個(gè)或多個(gè)低頻光子激發(fā)而輻射出一個(gè)高頻光子的納米級(jí)大小的粒子，它具有光穩(wěn)定性高、發(fā)射光譜譜線窄、熒光壽命長、化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。而且上轉(zhuǎn)換材料可以完全消除自發(fā)的背景熒光，能獲得超高的成像對(duì)比度。同時(shí)，由于是多光子發(fā)光過程，它還有著非常好的成像分辨率。在近紅外光(near infrared，NIR)激發(fā)下UCNPs可發(fā)射出近紅外光，具有較好的光學(xué)穿透深度，并且對(duì)生物組織也幾乎沒有損傷。以上這些優(yōu)勢(shì)都使UCNPs在生物光子學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用可能。

1 光學(xué)特性

1.1 UCNPs的激發(fā)、熒光光譜及發(fā)光原理

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料是一種在納米晶體基質(zhì)中摻雜RE離子(以Er3+，Tm3+，Ho3+和Yb3+為主)的復(fù)合納米材料，RE離子普遍具有多能級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)，在這幾種RE離子中，Yb3+充當(dāng)敏化離子(sensitizer)角色，而其他的RE離子充當(dāng)活化離子(activator)角色。整個(gè)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程包括敏化離子-活化離子之間的能量傳遞、敏化離子-敏化離子和激活離子-激活離子之間的能量轉(zhuǎn)移(圖2)。在這些能量轉(zhuǎn)移過程中會(huì)有雙光子和三光子過程，分別激發(fā)出綠光、紅光和藍(lán)光。上轉(zhuǎn)換的發(fā)光波長幾乎覆蓋了紫外、可見、以及紅外光區(qū)的光譜范圍［1，2］。

圖1 近年來發(fā)表有關(guān)QD和UCNPs在生物應(yīng)用研究中的論文數(shù)量比較Fig.1 A quantitative comparison of research activity in bio-applications of QD and UCNPs，measured as number of research articles per year

關(guān)于多種RE離子間能量轉(zhuǎn)移傳遞上轉(zhuǎn)換發(fā)光的過程機(jī)制，可以分為激發(fā)態(tài)吸收(excited state absorption，ESA)、能量傳遞上轉(zhuǎn)換(energy transfer upconversion，ETU)、交叉弛豫(cross relaxation，CR)、合作敏化上轉(zhuǎn)換(cooperative sensitization upconversion，CSU)和光子雪崩(photon avalanche，PA)等五種［2-4］。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的發(fā)光機(jī)制主要是基于能量傳遞上轉(zhuǎn)換過程，其他幾個(gè)能量傳遞過程也存在，但發(fā)生幾率很小。

圖2 敏化離子Yb3+與活化離子Er3+，Tm3+的能級(jí)結(jié)構(gòu)以及他們之間通過能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程的能級(jí)躍遷機(jī)制2Fig.2 Energy level structure and proposed UC mechanisms of the Yb3+，Er3+/Tm3+co-doped UCNPs

圖3 三種不同UCNPs:NaYbF4:Yb3+/Ho3+(綠)，NaFbF4:Yb3+/Er3+(紅)，NaFbF4:Yb3+/Tm3+(藍(lán))的發(fā)光光譜和發(fā)光照片5Fig.3 Photoluminescence spectra of NaYbF4:Yb3+/Er3+(red emission)，NaYbF4:Yb3+/Ho3+(green emission)，and NaYbF4:Yb3+/Tm3+(blue emission).The insets show the visible photoluminescence imaging of the UCNP colloidal suspension

1.2 UCNPs光學(xué)性質(zhì)

與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物不同，UCNPs可以用近紅外光激發(fā)而不是紫外光，從而明顯的減小了生物樣品的光致?lián)p傷，同時(shí)增大了激發(fā)光的穿透深度。這種上轉(zhuǎn)換激發(fā)所采用的反斯托克斯機(jī)制可以去除自發(fā)熒光進(jìn)行探測(cè)，從而帶來非常好的信噪比并且改善探測(cè)器的靈敏度。同時(shí)上轉(zhuǎn)換過程存在真實(shí)的直接能級(jí)，相比普通的雙光子發(fā)光現(xiàn)象有著更高的效率，在低功率密度照射下可以產(chǎn)生生物研究中所需要的穩(wěn)定適中的光強(qiáng)。UCNPs可以用小巧、廉價(jià)、低功率的近紅外激光器激發(fā)，重要的是在連續(xù)照射下不會(huì)產(chǎn)生閃爍、光漂白和光化學(xué)降解［6-8］。UCNPs的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它包含窄而清晰的發(fā)射峰(半高線寬，F(xiàn)WHM＜12 nm)，具有較長的熒光壽命(μs～ ms)［9，10］。

2 UCNPs的化學(xué)合成及修飾方法

2.1 UCNPs的組成材料

上轉(zhuǎn)換納米粒子一般由無機(jī)主基質(zhì)和摻雜在主基質(zhì)晶格中的鑭系離子組成，具體可參考圖5，摻雜的離子又分為敏化劑和活化劑。

研究上轉(zhuǎn)換所用到的主基質(zhì)很多，理想的主基質(zhì)有低的晶格聲子能量，這樣將使非輻射損失最小化，同時(shí)主基質(zhì)的晶格也要和摻雜離子相匹配以達(dá)到最好的摻雜效果。本文主要介紹的主基質(zhì)為NaYF4。

圖4 UCNPs沒有光致漂白和光閃爍現(xiàn)象:(a)單UCNPs在長時(shí)間探測(cè)后有光穩(wěn)定性;(b)UCNPs的時(shí)間分辨輻射;(c)分別用405，543和980 nm連續(xù)激光在1.6，0.13和19 mW下同時(shí)激發(fā)得到的焦面成像［6-8］Fig.4 Nonbleaching and nonblinking behavior of UCNPs:(a)Photostability of a single UCNP under longtime monitoring;(b)Time-resolved emission of UCNP，suggesting no on/off behavior;(c)Simultaneous excitations was provided by CW lasers at 405，543，and 980 nm with powers of approximately 1.6，0.13，and 19 mW in the focal plane，respectively

理論上大部分的RE離子都可以進(jìn)行上轉(zhuǎn)換發(fā)射，但在低強(qiáng)度激發(fā)功率下，只有少數(shù)的RE離子可以進(jìn)行上轉(zhuǎn)換發(fā)射，如Er3+，Ho3+和Tm3+用來做為活化劑。它們有著階梯狀的能級(jí)結(jié)構(gòu)，可以被近紅外光激發(fā)產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光。活化劑的含量都相對(duì)較低(一般＜2 mol%)，這樣以減小交叉弛豫的能量損失。

為了提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率并且使其在在近紅外區(qū)有足夠大的吸收截面，通常我們還需要一個(gè)敏化劑和活化劑共同摻雜。Yb3+相比于其他的鑭系元素離子，在900-1000 nm附近有一個(gè)較大的吸收截面，它作為敏化劑經(jīng)常與Er3+，Ho3+和Tm3+共同摻雜來提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率(圖2)。

2.2 合成方法

合適的尺寸和均一的形狀是上轉(zhuǎn)換納米粒子應(yīng)用于生物成像的前提。目前為止，有報(bào)道過多種合成高質(zhì)量UCNPs的方法，包括有共沉淀法［12］、水熱合成法［13］、熱分解法5、溶膠-凝膠法以及微乳液的合成方法。而在這些方法中，水熱合成法和熱分解法是最為常用來合成均一的、疏水性的納米粒子的方法。本綜述也主要介紹這兩個(gè)方法。

圖5 圖示為晶體主基質(zhì)和包含有鑭系離子的上轉(zhuǎn)換納米粒子示意圖(藍(lán)色及白色為主基質(zhì)分子，紅色為摻雜的離子)11Fig.5 Schematic illustration of UC nanoparticles composed of a crystalline host and lanthanide dopant ions embedded in the host lattice

2.2.1 水熱合成法 用水熱合成法合成上轉(zhuǎn)換納米粒子可以很好的控制納米粒子的大小和形狀，反應(yīng)是在密閉的高溫高壓環(huán)境中進(jìn)行的(如圖6)。一般在溶液中混合RE元素前驅(qū)體和氟化物前驅(qū)體，然后密閉在高壓容器中加熱反應(yīng)。經(jīng)常用到的RE元素前驅(qū)體為硝酸鹽、氯化物和氧化物，而較典型的氟化物前驅(qū)體為HF，NH4F，NaF和 NH4HF2，乙二胺四乙酸(EDTA)、溴化十六烷基三甲基銨硝酸鹽(CTAB)、油酸(OA)和檸檬酸三鈉鹽(TSC)為經(jīng)常用到的表面活性劑。Li［13-16］等人報(bào)道了一種簡單的相轉(zhuǎn)變及分離的方法(LSS)，用這種LSS方法成功合成了不同主基質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)、大小和形狀的納米粒子，如，BaY2F8，Ba2YF7，Ba2YbF7。Zhang［20］等人報(bào)道了一種新穎的容易使用的水熱合成法合成純的六方晶型NaYF4:Yb，Er/Tm納米粒子，此方法合成的納米粒子形狀可控而且上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)。

2.2.2 熱分解法 在熱分解過程中，三氟乙酸鹽被用作前驅(qū)體來分解得到相應(yīng)的金屬氟化物。Yan［21，22］等人創(chuàng)新性地提出了用 OA/OM/1-十八烯(ODE)與三氟乙酸鹽共熱的方法，以達(dá)到熱分解法需要的高溫(300℃)，并在反應(yīng)中調(diào)節(jié)前驅(qū)體的比例、反應(yīng)的溫度和時(shí)間、協(xié)調(diào)溶劑的屬性，來控制納米晶體的相、形態(tài)、大小，從而提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率。但在熱反應(yīng)的過程中不可避免地會(huì)產(chǎn)生一些有毒的副產(chǎn)物，如三氟乙酸醋酸酐(CF3CO)2O，三氟乙酰氟CF3CF2COF，羰基二氟化物 COF2和四氟乙烯C2F4，Wei［23］等人報(bào)道了一個(gè)更好的熱分解方法，通過RE-油酸鹽和NaF混合作為前驅(qū)體進(jìn)行熱分解得到α-和β-NaYF4UCNPs。Chow［24］等人提出油胺(OM)是唯一能使UCNPs從四方晶型轉(zhuǎn)變?yōu)榱骄偷娜軇?，Cohen［25］等人用以上控制條件及晶相的方法合成了低于10 nm的六方晶型的UCNPs。

圖6 UCNPs水熱合成法的步驟示意圖Fig.6 The schematic diagram of hydro(solvo)thermal method of UCNPs

2.3 UCNPs的表面修飾

通過以上方法合成的UCNPs一般為疏水性的，而要用于標(biāo)記生物發(fā)光，則需要通過表面修飾使其轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性的。到目前為止報(bào)道的方法很多，主要有配體交換、配體去除、靜電層層自裝法、配體氧化法、層層疊加法、聚合物包覆法、硅烷化及主客體相互作用法(表1)。

3 UCNPs發(fā)光效率優(yōu)化

3.1 材料合成優(yōu)化

對(duì)于上轉(zhuǎn)換材料而言，設(shè)計(jì)一個(gè)符合要求的晶體結(jié)構(gòu)是提高發(fā)光效率的關(guān)鍵性因素，這就需要考慮如何控制材料的晶相、粒度及離子摻雜等因素。

3.1.1 主基質(zhì)優(yōu)化 在熱分解和水熱法合成過程中，立方相的NaYF4首先形成，當(dāng)能量達(dá)到一定值時(shí)，就能克服晶體相變所需的自由能，立方相就能向六方相轉(zhuǎn)變［22，25］。(1)延長時(shí)間有助于克服立方相的 NaYF4向六方相轉(zhuǎn)變的自由能［22，52］。如圖 7 所示，在我們的試驗(yàn)中，Gd3+摻雜的NaYF4:20%Yb3+/30%Gd3+/2%Er3+納米顆粒半小時(shí)后顆粒呈不規(guī)則球狀，一小時(shí)后樣品呈非常規(guī)則的的六方相。(2)調(diào)控Na+、RE3+及Y-之間的摩爾比例。在大多數(shù)情況下，六方相的NaYF4不如立方相的NaYF4穩(wěn)定，采用高的 Na+/RE3+和 F-/RE3+比例有利于六方相的NaYF4形成［22，53-55］。(3)配體調(diào)制相變。油胺可以調(diào)制NaYF4的晶相由立方相向六方相轉(zhuǎn)變［24，25］。

表1 UCNPs的表面修飾方法Tab.1 Methods of surface functionalization of hydrophobic UCNPs

圖7 利用溶膠-凝膠法分別烘烤(a)半小時(shí)、(b)1小時(shí)后得到的NaYF4:20%Yb3+/30%Gd3+/2%Er3+的透射電鏡圖Fig.7 TEM images of using sol-gel method after baking NaYF4:20%Yb3+/30%Gd3+/2%Er3+for(a)0.5 h，(b)1 h

UCNPs的粒徑越小，比表面積就越大，意味著更多的缺陷和配體將存在于表面，會(huì)降低上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率。同時(shí)，由于顆粒大小會(huì)極大影響生物組織對(duì)顆粒的吸收及在生物組織中的分布，因此上轉(zhuǎn)換納米材料顆粒不能太大，否則就不適用于生物成像，故合成足夠小的納米顆粒的同時(shí)保持足夠的發(fā)光亮度是我們面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。研究者們通過改變表面活性劑(油酸和油胺)的濃度、Y3+/F-比例以及反應(yīng)溫度來調(diào)控合成直徑從4.5 nm到15 nm大小的蛋白質(zhì)尺寸的六方相NaYF4［25］，成功合成了小顆粒高亮度的UCNPs，這一進(jìn)展會(huì)拓展和深化UCNPs的生物應(yīng)用，特別是單分子成像中。

3.1.2 離子摻雜優(yōu)化 如圖8所示，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)光效率和摻雜RE離子的種類、RE離子間的摩爾比例有很大關(guān)系，發(fā)光強(qiáng)度最大的為Y3+:Yb3+:Tm3+(Er3+)=78:20:2。Li+摻雜到氧化物或氟化物上轉(zhuǎn)換納米材料中能增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光［56-61］，Ho3+摻雜離子能增強(qiáng)Tm3+的近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光［62］。

3.1.3 表面包覆保護(hù)殼層優(yōu)化 在上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料表面包覆上保護(hù)殼層，可以減少晶體缺陷、保護(hù)光學(xué)活性的離子，從而減少非輻射能量損失［63］。比較無殼層的BaGdF5:Yb3+/Er3+和包覆了活性殼層的BaGdF5:Yb3+/Er3+發(fā)光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)包覆了活性殼層的納米顆粒的發(fā)光強(qiáng)度較之無殼的有幾百倍的增加［64］。此外，將摻雜離子用一種層狀結(jié)構(gòu)隔離，能抑制焠滅效應(yīng)，有望使上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率得到增強(qiáng)［44，65，66］。

圖8 水熱法合成的5個(gè)不同樣品的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜及其對(duì)應(yīng)的圓薄片樣品圖Fig.8 Hydro(solvo)thermal method synthesis of 5 different samples of upconversion luminescence spectrum and its corresponding circular wafer sample diagram

3.2 表面等離子對(duì)輻射增強(qiáng)

眾所周知，金屬結(jié)構(gòu)獨(dú)特的表面等離子特性可以用來增強(qiáng)來自臨近熒光團(tuán)(有機(jī)染料和無機(jī)量子點(diǎn))的熒光［67，68］。同樣的，強(qiáng)局部場(chǎng)下的表面等離子共振也能用來增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換輻射效率。Zhang［69］等人和Sudheendra［70］等人成功的將納米金顆粒吸附在UCNPs表面實(shí)現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換輻射調(diào)制［71，72］。一種特制980 nm輻射金等離子表面對(duì)能明顯增強(qiáng)來自納米線層的從近紅外到可見光的上轉(zhuǎn)換發(fā)光［73］。對(duì)于有摻雜的上轉(zhuǎn)換納米顆粒和金屬納米顆粒的優(yōu)化設(shè)計(jì)來說，單納米顆粒表面等離子增強(qiáng)機(jī)理的研究是很重要的。然而，使用金屬納米顆粒增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換輻射進(jìn)行生物探測(cè)仍面臨很大的挑戰(zhàn)，如復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過程和苛刻的實(shí)驗(yàn)條件。

目前利用表面等離子對(duì)輻射的金屬增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換主要集中在玻璃復(fù)合材料和薄膜上，科學(xué)家們將銀或金的納米顆粒附著在UCNPs上可以增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換強(qiáng)度。Yan［74］等人第一次通過一種直接集合的方法將六方形NaYF4:Yb，Er納米顆粒和銀納米線配對(duì)觀察到了增強(qiáng)的上轉(zhuǎn)換輻射。紅光輻射(650 nm)比綠光輻射(550 nm)增強(qiáng)因數(shù)更大，并且可以使用聚集了銀顆粒的銀島得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。Schietinger［75］等人用一個(gè)光學(xué)和原子力顯微鏡相結(jié)合的設(shè)備觀察并控制單 NaYF4:Yb，Er納米顆粒與金納米球(60 nm)的距離，發(fā)現(xiàn)綠光輻射的增強(qiáng)是4.8，而紅光輻射下是2.7。Kennedy［72］等人發(fā)現(xiàn)了一種新型的光子材料，它是一種有非定型金殼層(4-8 nm)的立方NaYF4:Yb，Er/Tm納米晶體。在這種有等離子金殼層的NaYF4:Yb，Tm納米顆粒下觀察到的從近紅外到可見光的上轉(zhuǎn)換增強(qiáng)達(dá)到了8。Duan［71］等人通過六方形NaYF4:Yb，Tm和金納米顆粒的等離子接觸調(diào)制了上轉(zhuǎn)換輻射，并且在452-476 nm的范圍內(nèi)得到了超過150%的輻射強(qiáng)度增強(qiáng)，而647 nm處只有50%左右的增強(qiáng)。最近，Qin［76］等人通過將金納米顆粒(10 nm)吸附在NaYF4:Yb，Tm表面，觀察到對(duì)于這種納米復(fù)合材料上轉(zhuǎn)換輻射在波長291 nm和345 nm分別增強(qiáng)了73.7和109.0。

3.3 波長優(yōu)化

在它的所有應(yīng)用中，激發(fā)光都是采用的975 nm附近(如980 nm)的連續(xù)激光，但生物體內(nèi)的主要成分--水在這個(gè)波長附近吸收非常的強(qiáng)，這樣就降低了成像深度并造成了明顯的熱效應(yīng)［77］。因此，對(duì)于上轉(zhuǎn)換效率在波長方面的優(yōu)化也有它的必要性，2011年 Zhan［27］等人在國際上首次提出了915 nm光作為上轉(zhuǎn)換材料的新激發(fā)光源波長，在生物成像中具有更深的成像深度和更低的熱損傷。使用同樣強(qiáng)度的500 mWcm-2的915 nm和980 nm連續(xù)脈沖激光照射3 min后，溫度分別達(dá)到32.2℃和45℃。

圖9 優(yōu)化上轉(zhuǎn)換成像中的激發(fā)模式實(shí)現(xiàn)低熱無損、深度組織成像Fig.9 The optimization of conversion imaging excitation mode to realize low thermal condition，depth tissue imaging

4 UCNPs的生物應(yīng)用

UCNPs生物成像由于具有無自發(fā)熒光、大的反斯托克斯位移、窄的發(fā)射峰、高耐光漂白、無光閃爍、探測(cè)深度大以及高的空間分辨率等優(yōu)良的光學(xué)特性，因此近幾年來很多人致力于UCNPs的生物光子學(xué)應(yīng)用。目前在細(xì)胞成像、動(dòng)物成像、生物傳感、漫射光成像、光動(dòng)力治療(PDT)、多模式成像(MRI/PET)等方面有眾多應(yīng)用。

圖10 UCNPs的生物應(yīng)用Fig.10 The biological application of UCNPs

4.1 細(xì)胞成像

近幾年來，隨著上轉(zhuǎn)換納米粒子性能的改進(jìn)，基于UCNPs的顯微技術(shù)被廣泛應(yīng)用于高分辨和高對(duì)比的離體細(xì)胞的成像。

在無抗體標(biāo)記的細(xì)胞中，用UCNPs吸附在細(xì)胞膜上或被細(xì)胞內(nèi)吞來進(jìn)行成像。最近，Jin［78］等人制備了三種類型的聚合物包覆的UCNPs，發(fā)現(xiàn)了相比于中性和帶負(fù)電荷的聚合物，用帶正電荷的PEI包覆的UCNPs可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)UCNPs的攝取能力。2008年 Nyk［79］等人成功將 MSA-UCNPs應(yīng)用到標(biāo)記Panc 1細(xì)胞進(jìn)行高對(duì)比成像(圖11)。

相比于無抗體標(biāo)記的細(xì)胞成像，有抗體標(biāo)記的成像會(huì)有更多優(yōu)點(diǎn)，尤其是在腫瘤細(xì)胞靶向成像中有更廣泛的應(yīng)用。表面功能化的UCNPs通過生物分子識(shí)別與癌細(xì)胞特異性相結(jié)合，2009年 Wang［80］等人提出用anti-CEA8于UCNPs結(jié)合來進(jìn)行細(xì)胞成像(圖12)。Zhan［27］等人最近報(bào)道了一系列對(duì)比可控實(shí)驗(yàn)，說明了將NaYF4:Yb3+/Er(Ho)3+與anti-CEA8的抗體相結(jié)合，可以特異性地與Hela癌細(xì)胞膜結(jié)合，從而進(jìn)行成像。

4.2 動(dòng)物成像

UCNPs的快速發(fā)展使得其實(shí)現(xiàn)了在活體中的成像，在早期的研究中，包括皮下注射和UCNPs在生物中的分布成像。Salthouse等［81］人研究了在老鼠的尾巴靜脈注射UCNPs后的積累，結(jié)果表明PEG-UCNPs沒有首先靶向積累在小鼠的肝、脾等處，另外長時(shí)間觀察發(fā)現(xiàn)在活體樣品中注射UCNPs 7天后，還可以觀察到體內(nèi)有其存在。

圖11 用UCNPs處理的Panc1細(xì)胞的透射成像(左)和光致發(fā)光成像(右)。插圖為局部細(xì)胞(紅色)和背景(黑色)的光致發(fā)光光譜圖［79］Fig.11 In vitro transmission(left)and PL(right)images of Panc 1 cells treated with UCNPs.Inset shows localized PL spectra taken from cells(red)and background(black)

圖12 用兔子的anti-CEA8與UCNPs結(jié)合后與He-La細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行亮場(chǎng)成像(a)，和用不同功率980 nm NIR激光激發(fā)(b)100，(c)300，(d)500，(e)700，和(f)900 mW［80］Fig.12 Fluorescence imaging of HeLa cells after incubated with rabbit anti-CEA8 Ab-conjugated UCNPs in bright field(a)，and excited by a 980 nm NIR laser with different excitation powers:(b)100，(c)300，(d)500，(e)700，and(f)900 mW

由于淋巴排水系統(tǒng)是癌細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)重要途徑，但淋巴結(jié)的復(fù)雜微小結(jié)構(gòu)使得很難對(duì)它進(jìn)行識(shí)別，用NaYF4:Yb，Er和NaYF4:Yb，Tm納米粒子作為熒光探針，Kobayashi［82］等人第一次提出了無內(nèi)源熒光的小鼠的淋巴結(jié)雙顏色成像。同樣的問題也出現(xiàn)在血管成像中，疾病中血管變化及血管功能紊亂，血管成像能提供血管的數(shù)量和間距、血管系統(tǒng)的滲透性及血管的異常，Zhang等［83］人報(bào)道了用硅烷包覆的NaYF4:Yb，Er UCNPs來動(dòng)態(tài)跟蹤小鼠耳朵的成肌細(xì)胞來對(duì)血管成像。

到目前為止，在小動(dòng)物中的成像做了多方面研究，而針對(duì)于腫瘤的成像在腫瘤的診斷和治療方面是非常重要的。目前，UCNPs結(jié)合葉酸、抗體和多肽能用于活體腫瘤靶向成像。F.Y.Li［84］小組近期提出了一個(gè)環(huán)肽(c(RGDFK))修飾的NaYF4:Yb，Er，Tm，并用 PEG修飾(UCNP-RGD)，來靶向成標(biāo)記αvβ3-過量表達(dá)的老鼠腫瘤(人類惡性膠質(zhì)瘤U87MG)(圖13)。

圖13 依據(jù)時(shí)間的上皮U87MG腫瘤上轉(zhuǎn)換發(fā)光(左后腿，短箭頭指出)和MCF-7腫瘤(右后腿，長箭頭指出)在無胸腺的裸鼠上實(shí)驗(yàn)，在經(jīng)脈注射UCNP-RGD 24 h 后［84］Fig.13 Time-dependent in vivo upconversion luminescence imaging of subcutaneous U87MG tumor(left hind leg，indicated by short arrows)and MCF-7 tumor(right hind leg，indicated by long arrows)borne by athymic nude mice after intravenous injection of UCNPRGD over a 24 h period

4.3 生物傳感

作為波爾茲曼分布的一個(gè)性質(zhì)，UCNPs的不同發(fā)射譜帶的相對(duì)強(qiáng)度會(huì)依賴于周圍的環(huán)境。由于這個(gè)原因，UCNPs被提出作為納米溫度傳感器。最近，基于UCNPs的光學(xué)溫度傳感器被應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)部溫度的探測(cè)，Vetrone等［85］人提出了用綠色上轉(zhuǎn)換發(fā)光的NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子，用于Hela宮頸癌細(xì)胞的溫度傳感。

作為最有效的生物傳感工具，基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的方法能用于檢測(cè)生物親和性相互作用并使生物分子在納米級(jí)范圍內(nèi)產(chǎn)生改變。當(dāng)UCNPs被用作供體分子時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生許多新的應(yīng)用可能性，這就是發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移(LRET)。Soukka等［86，87］人在基于上轉(zhuǎn)換納米粒子的 LRET傳感上做了很多研究，他們提出了一個(gè)新穎的上轉(zhuǎn)換LRET傳感技術(shù)及其在多方面的潛在應(yīng)用可能，如在血清中對(duì)E2(17β雌二醇)免疫測(cè)定、酶活性實(shí)驗(yàn)、雙參數(shù)DNA雜交試驗(yàn)。

4.4 漫射光層析成像

漫射光成像已經(jīng)廣泛應(yīng)用在了小動(dòng)物和人體組織的成像探測(cè)上。在人體上，漫射光成像，已經(jīng)用于探測(cè)乳腺癌腫瘤，腦活動(dòng)和腦新陳代謝［88-93］。然而，由于內(nèi)源組織自發(fā)背景熒光、光在組織中傳遞的隨機(jī)性等問題的存在，漫射光成像得到的成像效果相對(duì)不是很好?，F(xiàn)有的一些改善成像質(zhì)量的方法設(shè)備復(fù)雜、計(jì)算繁多。而上轉(zhuǎn)換激發(fā)完全去除自發(fā)熒光，由圖14我們可以看出即使很弱的自發(fā)背景熒光也會(huì)給成像精度產(chǎn)生嚴(yán)重的影響［94］，同時(shí)上轉(zhuǎn)換激發(fā)不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，而較大的反斯托克斯位移也使激發(fā)光和發(fā)射光易分開。相比傳統(tǒng)的有機(jī)染料(下轉(zhuǎn)換發(fā)光過程)，上轉(zhuǎn)換納米材料的非線性性質(zhì)可以獲得更高的分辨率，這也是UCNPs在漫射光成像上的一大優(yōu)勢(shì)。

圖14 一個(gè)組織圖像中兩個(gè)圓柱形熒光目標(biāo)的熒光漫射光成像重構(gòu)圖 (a)使用UCNPs進(jìn)行的重構(gòu);(b)使用羅丹明6G進(jìn)行的重構(gòu)［94］Fig.14 LDOT reconstruction of two cylindrical luminescent targets in a tissue phantom.Reconstruction using(a)UCNPs;(b)Rhodamine 6G

4.5 輔助光動(dòng)力治療

在臨床醫(yī)學(xué)上對(duì)癌癥的診斷和治療中，成像和治療是不可分開的。不同于化學(xué)療法、放射性療法和外科手術(shù)，光動(dòng)力治療(photodynamic therapy，PDT)作為一個(gè)治療癌癥的技術(shù)，是被高能量光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧類(ROS)來殺死病變細(xì)胞。在癌癥組織中，有望能用980 nm的連續(xù)激光激發(fā)UCNPs穿透深層組織達(dá)到治療效果。Austin［95］首次提出了用三層的NaYF4:Yb，Er與卟啉共同定位的光動(dòng)力治療。Zhang等人在 2009［96］年和 2010 年［97］分別報(bào)道了 NaYF4:Yb，Er@nSiO2@mSiO2和 NaYF4:Yb，Er@mSiO2納米粒子將 ZnPc包含在介孔的 SiO2中，在500 mW 980 nm的連續(xù)激光下激發(fā)5 min，就可以從介孔SiO2中釋放活性氧，達(dá)到PDT的治療效果。

在最近的研究工作中，Zhang等［83］人又用葉酸(FA)和PEG修飾的UCNPs分別與不做修飾及只用PBS來治療小鼠作為對(duì)比(圖15)，可以看到PDT的明顯治療效果。

圖15 照片為每組1-3只小鼠分別靜脈注射FAPEG-UCNs、未修飾的UCNP和PBS，照片顯示了注射PDT前(0 d)和注射后(7 d)的腫瘤大小的改變(用虛線圓圈標(biāo)出)。標(biāo)尺10 mm［83］Fig.15 Representative gross photos of a mouse from each group 1-3 intravenously injected with FA-PEGUCNs，unmodified UCNs or PBS showing the change in tumor size(highlighted by dashed white circles)before(0 d)and 7 d after PDT treatment.Scale bars，10 mm

4.6 多模式成像

目前，分子多模式成像的技術(shù)主要集中在X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(CT)、核磁共振成像(MRI)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)、正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)和超聲成像等［99-101］。近年來，大量的光致發(fā)光材料的出現(xiàn)，催生了一大批研究者對(duì)于促進(jìn)在多模式造影劑存在時(shí)分子光學(xué)成像研究的興趣［102-103］，但明亮和穩(wěn)定的多模式造影劑難以找到，發(fā)光探針在多模式造影劑上容易降解和漂白。然而，UCNPs很穩(wěn)定，不存在漂白和老化現(xiàn)象，且多模式成像可以通過修飾晶體主體材料實(shí)現(xiàn)。漫射光成像，即使利用UCNPs，其空間分辨率依然不高［104］;CT和MRI具有高的分辨率，卻難以得到所需的信息;PET能提供手術(shù)前的一些詳細(xì)數(shù)據(jù)，卻不能很好適用于術(shù)后。主要討論的是，基于UCNPs的多模式成像，如磁-光學(xué)成像、核-光學(xué)成像、CT-三模式成像。

5 總結(jié)與展望

文章綜述了上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子的合成方法、光學(xué)特性、發(fā)光效率的優(yōu)化及在生物方面的應(yīng)用。作為新一代生物發(fā)光標(biāo)記材料，UCNPs展現(xiàn)了許多優(yōu)點(diǎn)，例如毒性小、無背景熒光、化學(xué)穩(wěn)定性高、光穩(wěn)定性好、光穿透能力強(qiáng)等。近幾年里對(duì)UCNPs的生物應(yīng)用研究急劇增加，展現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換納米粒子的潛在應(yīng)用價(jià)值。

但是盡管UCNPs有著快速強(qiáng)勁的發(fā)展，它仍然有著較低的發(fā)光效率，表面修飾有待改進(jìn)，PDT的效率仍然不高。在未來的工作中，我們需要進(jìn)一步優(yōu)化材料合成，得到發(fā)光效率更高的納米粒子。同時(shí)也要優(yōu)化激發(fā)模式，發(fā)展上轉(zhuǎn)換成像的專業(yè)儀器，推動(dòng)該領(lǐng)域更多更好的研究工作的展開。最后重要的是研究要向臨床應(yīng)用發(fā)展，能達(dá)到確實(shí)診斷、治療疾病的目的。

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