鄧妍妍 沈建明 楊 靜

氨基糖甙類藥物是臨床常用抗生素，其腎毒性限制了臨床應(yīng)用。在氨基糖甙類腎毒性的發(fā)生機(jī)制中，氧化應(yīng)激具有重要作用。腎康注射液作為中藥復(fù)方制劑，已應(yīng)用于臨床治療糖尿病腎病、慢性腎衰竭等，研究發(fā)現(xiàn)該藥具有抗氧化應(yīng)激的作用，我們對慶大霉素腎損傷大鼠予以腎康注射液干預(yù)，以探討其對慶大霉素腎損傷時(shí)腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量230±20g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(質(zhì)量合格證:00021068)。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠腹腔注射慶大霉素［100mg/(kg·d)，共持續(xù)7天］制備腎損傷模型，假手術(shù)組予以0.9%氯化鈉注射液注射［2.25ml/(kg·d)，共持續(xù)7天］。治療組予以腹腔注射腎康注射液2g/(kg·d)(西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司，規(guī)格:20ml/支，含生藥6g)7天，假手術(shù)組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液注射［6.67ml/(kg·d)］7天，大鼠兩次注射間隔4小時(shí)。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)第8天將各組大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(5ml/kg)麻醉后，開腹由下腔靜脈取血5ml離心(3000r/min，5分鐘)后留取血清備用。經(jīng)腹主動(dòng)脈注入4℃等滲磷酸鹽緩沖液(PBS液)(pH7.4)100ml灌洗至腎臟轉(zhuǎn)為蒼白留取左側(cè)腎臟，置于4%多聚甲醛溶液固定備用;留取右腎組織，用錫箔紙迅速包好后置入液氮罐中，并于－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 腎功能檢測:全自動(dòng)生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平。

1.4.2 腎臟病理HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理學(xué)改變。

1.4.3 腎組織氧化還原指標(biāo)檢測:按重量體積比加生理鹽水制備成10%的腎組織勻漿，再按試劑盒說明書操作，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)直接法檢測谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性(試劑盒均購自南京建成生物工程研究所)。

2.結(jié)果

2.1 三組大鼠腎功能比較 模型組BUN(19.83±3.25比5.59±1.43mmol/L)和Scr(289.29±34.61比49.36±13.24μmol/L)水平高于假手術(shù)組，治療組 BUN(11.37±2.17mmol/L)和Scr(173.82±22.05μmol/L)水平均低于模型組(P＜0.05)。

2.2 三組大鼠腎臟病理改變比較 假手術(shù)組大鼠的腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)基本正常;模型組可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹，可見局灶性壞死脫落，管壁破壞，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤;治療組大鼠的腎臟損傷均較模型組輕，見圖1。

圖1 三組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)比較(HE×400)

2.3 三組大鼠腎組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較 模型組SOD、GSH-Px活性在低于假手術(shù)組，治療組SOD、GSH-Px活性高于模型組;模型組MDA含量高于假手術(shù)組，治療組MDA含量低于模型組(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠腎組織SOD活性、MDA含量比較(x ± s，n=10)

3.討論

與國外Otunctemur等對大鼠連續(xù)14天腹腔注射慶大霉素［100mg/(kg·d)］制備腎損傷模型相似［1］，本研究中，模型組連續(xù)7天腹腔注射慶大霉素后，BUN和Scr明顯高于假手術(shù)組，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腎小管損傷，提示慶大霉素腎損傷模型制備成功。腎康注射液是由大黃、黃芪、紅花、丹參、川芎等中藥制成的復(fù)方制劑，國內(nèi)樓炳恒等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)腎康注射液可以減輕體外循環(huán)犬的急性腎損傷、保護(hù)腎功能［2］。我們研究發(fā)現(xiàn)，給予腎康注射液干預(yù)后，大鼠BUN和Scr水平低于模型組，腎小管損傷減輕，說明腎康注射液可以減輕慶大霉素腎損傷，改善腎功能。

慶大霉素引起腎損傷的機(jī)制比較復(fù)雜。慶大霉素進(jìn)入機(jī)體后，99%以原形的形式經(jīng)腎小球?yàn)V過，其中約40%被近端小管重吸收，造成藥物在腎間質(zhì)中的濃度約為血漿濃度的20～30倍，進(jìn)而誘導(dǎo)氧自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致腎小管損傷。SOD、GSH-Px和MDA是反映氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)［3］。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可以在鈣的參與下造成細(xì)胞成分的損傷和功能代謝障礙。SOD和GSH-Px能保護(hù)細(xì)胞，降低細(xì)胞凋亡和死亡的風(fēng)險(xiǎn)，間接反映機(jī)體清除自由基的能力;當(dāng)SOD和GSH-Px活性下降時(shí)可導(dǎo)致清除氧自由基的能力下降，導(dǎo)致氧自由基在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)積聚，造成細(xì)胞損傷，氧自由基增多又通過膜脂質(zhì)過氧化或氧化酶活性基團(tuán)等多種途徑影響酶活性，形成惡性循環(huán)。本研究中，模型組SOD和GSH-Px活性在低于假手術(shù)組、MDA含量高于假手術(shù)組，這與國外Bekheet等［4］研究相似，也證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)參與慶大霉素腎損傷。國內(nèi)蔣文勇等［5］研究發(fā)現(xiàn)，對于慢性腎衰竭患者，腎康注射液可以清除氧自由基、提高抗氧化活性、減輕氧化作用所致的器官損傷。本研究中，給予給予腎康注射液干預(yù)后，腎組織SOD和GSH-Px活性升高、MDA含量減少，說明該藥可以減輕慶大霉素腎損傷時(shí)腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。國外研究也證實(shí)通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)可以減輕慶大霉素所致腎損傷、保護(hù)腎功能［6］。

綜上所述，腎康注射液可以減輕慶大霉素腎損傷、保護(hù)腎功能，其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。

1 Otunctemur A，Ozbek E，Cekmen M，et al.Protective effect of montelukast which is cysteinyl-leukotriene receptor antagonist on gentamicininduced nephrotoxicity and oxidative damage in rat kidney［J］．Ren Fail，2013，35(3):403 －410.

2 樓炳恒，張偉文，吳華勇.腎康注射液對體外循環(huán)犬的腎保護(hù)作用［J］．全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2012，10(6):646－648.

3 王英.冬蟲夏草對維持性血液透析患者氧化應(yīng)激的影響［J］．中國老年保健醫(yī)學(xué)，2013，11(1):31－32.

4 Bekheet SH，Awadalla EA，Salman MM，et al.Prevention of hepatic and renal toxicity with bradykinin potentiating factor(BPF)isolated from Egyptian scorpion venom(Buthus occitanus)in gentamicin treated rats［J］．Tissue Cell，2013，45(2):89 －94.

5 蔣文勇，吳欣，于黔.腎康注射液對老年慢性腎衰竭患者氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響［J］．中國老年學(xué)雜志，2011，31(10):3825－3826.

6 Cekmen M，Otunctemur A，Ozbek E，et al.Pomegranate extract attenuates gentamicin-induced nephrotoxicity in rats by reducing oxidative stress.Ren Fail，2013，35(2):268 －274.