劉 倩， 張 慜*， 容小紅， 趙科金

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.海通食品集團(tuán)股份有限公司，浙江 慈溪 315300）

青菜屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，是以葉片為產(chǎn)品的普通白菜的一個(gè)變種，原產(chǎn)中國(guó)。青菜可以保持血管彈性，提供人體所需礦物質(zhì)、維生素，其中的維生素B2尤為豐富，有抑制潰瘍的作用，經(jīng)常食用對(duì)皮膚和眼睛的保養(yǎng)有很好的效果。富含纖維，可以有效改善便秘。

存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）在適宜的條件下能引起果蔬的酶促褐變，因此，多酚氧化酶對(duì)于食品加工具有重要意義。PPO是一種對(duì)溫度比較敏感的酶類(lèi)，在高溫條件下很容易失活。果蔬中的過(guò)氧化物酶（peroxidase）往往具有較高的熱穩(wěn)定性，對(duì)果蔬進(jìn)行熱燙處理時(shí)，常以過(guò)氧化物酶是否失活作為熱燙是否充分的標(biāo)準(zhǔn)。較高的POD和PPO活性會(huì)導(dǎo)致酚類(lèi)化合物的降解，從而引起酶促褐變[1]。熱處理的主要目的是殺死微生物和破壞酶的活性，防止水煮葉菜類(lèi)產(chǎn)品在保藏過(guò)程中變色、變味和營(yíng)養(yǎng)成分的損失，從而提高產(chǎn)品的保質(zhì)期。果蔬熱燙之后，如果其過(guò)氧化物酶完全（或95%以上）被破壞，那么就可以認(rèn)為存在于果蔬中的其它酶都已失活。各種蔬菜獲得最佳品質(zhì)其殘留酶活性不超過(guò)10%，大多在5%左右[2-3]。許多研究表明果蔬中的過(guò)氧化物酶有熱穩(wěn)定和熱不穩(wěn)定兩部分。這兩部分的比例取決于果蔬的品種和熱燙處理的溫度。

因此，作者以青菜為原料，研究了不同燙漂處理后青菜中過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的活性，葉綠素的含量以及色澤，確定了青菜熱燙前處理的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

新鮮上海青：購(gòu)于江蘇無(wú)錫市石塘街市場(chǎng)。

愈創(chuàng)木酚（0.05 mol/L）、鄰苯二酚（0.1 mol/L）、磷酸緩沖溶液、H2O2（體積分?jǐn)?shù)2%）：均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器設(shè)備

FA1104型電子天平：上海天平儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；CR-400色差計(jì)：日本 Onica Minolta公司產(chǎn)品；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；UV2600紫外分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青菜中過(guò)氧化物酶熱穩(wěn)定性的探究 愈創(chuàng)木酚法[4-5]。

1）過(guò)氧化物酶的提取 稱(chēng)取0.5 g新鮮青菜的葉子于研缽中，加入2 mL磷酸緩沖溶液（0.05 mol/L）研成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管中，再加3 mL磷酸緩沖溶液（0.05 mol/L）沖洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，等重后于8 000 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液[6]。

2）最適波長(zhǎng)的確定 取適量酶液0.4 mL至于已編號(hào)的離心管中，于室溫下靜置。向離心管中加入2.9 mL磷酸緩沖液 （0.05 mol/L），1.0 mL愈創(chuàng)木酚溶液（0.05 mol/L），最后加入體積分?jǐn)?shù)2%的H2O2溶液1 mL，混勻后立即計(jì)時(shí)，1 min后在400～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，測(cè)定過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生有色物質(zhì)的最適波長(zhǎng)。

3）過(guò)氧化物酶活性的熱處理 取適量酶液0.4 mL分別置于已編號(hào)的離心管中，將試管在60℃水浴中保溫1 min后，分別移至85、90、95℃水浴鍋中，處理2、3、4 min，然后立即將試管轉(zhuǎn)移至冰浴中，快速冷卻至0℃[7]。

4）過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定 向盛有酶液且經(jīng)過(guò)不同熱處理的離心管以及室溫下靜置的離心管中加入2.9 mL磷酸緩沖液 （0.05 mol/L），1.0 mL愈創(chuàng)木酚溶液（0.05 mol/L），最后加入體積分?jǐn)?shù)2%的H2O2溶液1 mL，混勻后立即計(jì)時(shí)，于最適波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)混合物吸光值隨時(shí)間的變化，每隔30 s讀數(shù)一次，讀10次。參比采用加熱煮沸5 min后的酶液。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 青菜中多酚氧化酶的研究 鄰苯二酚法[4-5]。

1）青菜中多酚氧化酶的提取 分別稱(chēng)取新鮮的和變黃的的葉子0.5 g，加入3 mL磷酸緩沖液（pH 6.94），冰浴研磨勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管，再用 3 mL磷酸緩沖液（pH 6.94）沖洗研缽，合并提取液。4℃冷凍離心（6 000 r/min）12 min，上清液即為粗酶液[8]。

2）新鮮青菜中多酚氧化酶活性的測(cè)定 在試管中，加入2.0 mL磷酸緩沖液（pH 6.94），5.0 mL兒茶酚（鄰苯二酚）以及1 mL新鮮青菜中提取的粗酶液，空白采用1 mL加熱煮沸5 min的新鮮青菜葉子中的酶液，煮沸結(jié)束后于4℃冷凍離心 （6 000 r/min）12 min 后，冰浴待用[9-10]。

A值測(cè)定：加入粗酶液后迅速混勻，30 s后立刻于410 nm下測(cè)定反應(yīng)體系的A值，每隔30 s記錄一次，共記錄10次。

3）貯藏過(guò)程中不同程度腐敗的的青菜中多酚氧化酶活性的測(cè)定 在試管中，加入2.0 mL磷酸緩沖液（pH 6.94），5.0 mL兒茶酚（鄰苯二酚）以及 1 mL從略腐敗以及腐敗較嚴(yán)重的青菜中提取的粗酶液，空白分別采用1 mL加熱煮沸5 min的略腐敗以及腐敗較嚴(yán)重的青菜中提取的粗酶液，煮沸結(jié)束后于4℃冷凍離心（6 000 r/min）12 min，冰浴待用。

A值測(cè)定：加入粗酶液后迅速混勻，30 s后立刻于410 nm下測(cè)定反應(yīng)體系的A值，每隔30 s記錄一次，共記錄10次。

4）是否轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻對(duì)新鮮青菜中多酚氧化酶活性影響的測(cè)定 在兩只試管中，加入2.0 mL 磷酸緩沖液（pH 6.94），5.0 mL兒茶酚（鄰苯二酚）以及分別加入1 mL由95℃2 min處理后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻與未冷卻的新鮮青菜中提取的多酚氧化酶的粗酶液，空白采用1 mL加熱煮沸5 min的新鮮青菜中提取的粗酶液 ，煮沸結(jié)束后用4℃冷凍離心（6 000 r/min）12 min，冰浴待用。

A值測(cè)定：加入粗酶液后迅速混勻，30 s后立刻于410 nm下測(cè)定反應(yīng)體系的A值，每隔30秒記錄一次，共記錄10次。

1.3.3 試驗(yàn)指標(biāo)與測(cè)定

1）酶活的測(cè)定 過(guò)氧化物酶酶活的計(jì)算公式以每分鐘A470nm變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活單位（U）。

式中：ΔA470nm為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD變化值；VT為提取酶液總體積（mL）；m 為植物鮮重（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）。

多酚氧化酶活性的計(jì)算公式以每分鐘A410nm值增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

式中：ΔA410nm為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD變化值；VT為提取酶液總體積（mL）；m 為植物鮮重（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）。

以未經(jīng)熱處理的酶液的酶活力作為1，計(jì)算經(jīng)不同熱處理后酶液中的相對(duì)殘余活力。

2）色差測(cè)定 樣品研碎后用色差計(jì)測(cè)定亨特爾L*值，a*值b*值，標(biāo)準(zhǔn)白板調(diào)零，以濕片的色值為基準(zhǔn)。

L*值表示亮度，L*越大亮度越大；b*值表示有色物質(zhì)的黃藍(lán)偏向，正值越大越偏向黃色，而負(fù)值越大則越偏向藍(lán)色；a*值表示有色物質(zhì)的紅綠偏向，正值越大越偏向紅色，而負(fù)值越大則越偏向綠色。

C*即色度又叫飽和度，它是樣品灰暗/鮮艷比例的一個(gè)指標(biāo)（從0到60），可按照下面的公式進(jìn)行計(jì)算。

3）葉綠素含量的測(cè)定 參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和指導(dǎo)》，略有改動(dòng)[4-5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)產(chǎn)物最適波長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果

由圖1可確定過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生有色物質(zhì)A的最適波長(zhǎng)為470 nm，在此處吸光值A(chǔ)達(dá)到最大值0.503。

圖1 過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)產(chǎn)物最適波長(zhǎng)Fig.1 Optimalwavelength ofperoxidase catalyzed reaction product

2.2 新鮮青菜中過(guò)氧化物酶的活性

新鮮青菜中過(guò)氧化物酶的活性見(jiàn)表1。由表1可知，未經(jīng)熱處理青菜中過(guò)氧化物酶的活性為460.23/（g·min），是比較高的。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中過(guò)氧化物酶催化的反應(yīng)體系的茶褐色隨時(shí)間的增加在不斷加深。這說(shuō)明過(guò)氧化物酶在不斷地催化H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化為茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚[7]。

表1 新鮮青菜中過(guò)氧化物酶的活性Table 1 Peroxidase activity of fresh Brassicachinensis L.

2.3 不同條件熱處理后青菜中過(guò)氧化物酶的活性及對(duì)殘余活力

由表2可以看出，POD酶較難完全失活。100℃下需熱燙5 min才能完全失活，但熱燙時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重破壞綠葉蔬菜的組織細(xì)胞，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和色素?fù)p失較多，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。為了進(jìn)一步選擇比較好的熱燙條件，所以選擇了不同的熱燙條件研究POD酶的活性情況。

表2 熱燙條件與POD酶活的關(guān)系Table 2 Blanching conditions with the relationship of POD activity

以未經(jīng)熱處理酶液的酶活力作為1，計(jì)算經(jīng)不同熱處理后酶液中的相對(duì)殘余活力，所得結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同熱處理后過(guò)氧化物酶的相對(duì)殘余活力Fig.2 Relative residual activity of peroxidase after different conditions of blanching

各種蔬菜獲得最佳品質(zhì)其殘留酶活性不超過(guò)10%，大多在5%左右，通常以過(guò)氧化物酶（POD）的活性大?。ㄊ卟酥凶钅蜔岬拿福﹣?lái)作為蔬菜熱燙是否充分的指標(biāo)。

由表3和圖2可知，當(dāng)選擇90℃4 min、95℃2 min、95℃ 3 min以及95℃ 4 min的熱處理?xiàng)l件時(shí)，相對(duì)殘余酶活力是低于10%的。

2.4 多酚氧化酶活性的測(cè)定

新鮮青菜中與不同程度腐敗的青菜中多酚氧化酶活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

表3 經(jīng)過(guò)不同條件熱處理后青菜中過(guò)氧化物酶的活性Table 3 Peroxidase activity of Brassicachinensis L.after different conditions of blanching

圖3 新鮮與不同程度腐敗的青菜中多酚氧化酶的活性Fig.3 Polyphenol oxidase activity of fresh and different corruption degrees of Brassicachinensis L.

由圖3的結(jié)果可知，青菜中多酚氧化酶的活性隨著腐敗程度的增加有遞增的趨勢(shì)，這說(shuō)明青菜在貯藏過(guò)程中的腐敗與多酚氧化酶存在一定的關(guān)系，通過(guò)抑制多酚氧化酶的活性，可以在一定程度上抑制青菜的腐敗現(xiàn)象。

2.5 冰浴條件下冷卻對(duì)新鮮青菜中多酚氧化酶活性的影響

由表4和圖4可知，新鮮青菜經(jīng)過(guò)95℃2 min的熱燙處理后，青菜中多酚氧化酶的活性大大降低。而且95℃2 min處理后未轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻與迅速轉(zhuǎn)移到冰浴條件中冷卻的新鮮青菜中多酚氧化酶的活性相比，95℃2 min處理后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴條件中冷卻的新鮮青菜中多酚氧化酶的活性更低， 為2.31 U/（g·min）， 相對(duì)殘余活力已降至1.24%。而95℃2 min處理后未轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻的新鮮青菜中多酚氧化酶活性為30.77 U/（g·min），相對(duì)殘余活力為16.49%。

這是由于熱處理后未轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻的青菜中多酚氧化酶在室溫條件下發(fā)生了再生，而熱處理后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴條件，可以使溫度迅速下降到0℃。當(dāng)溫度接近0℃時(shí)酶的再生受到抑制，這可以更好地降低多酚氧化酶的活性[8]。

表4 經(jīng)過(guò)不同條件處理后青菜中多酚氧化酶的活性Table 4 Polyphenol oxidase activity of Brassicachinensis L.after different treatment

圖4 不同處理后新鮮青菜中多酚氧化酶的相對(duì)殘余活力Fig.4 Relative residual activity of polyphenol oxidase after different treatment

圖5 不同熱處理后青菜中葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.5 Chlorophyll content of Brassicachinensis L.after different blanching

表5 95℃2 min處理后青菜的色澤指標(biāo)Table 5 Green color indicators of Brassicachinensis L.after blanching for 2 min at 95℃

以未經(jīng)熱處理的酶液的酶活力作為1，計(jì)算經(jīng)不同熱處理后酶液中PPO的相對(duì)殘余活力。

2.6 不同熱處理對(duì)青菜色澤的影響

2.6.1 不同熱處理后青菜中葉綠素的含量 由圖5可知，經(jīng)過(guò)不同熱處理，青菜中葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有差別。當(dāng)熱處理?xiàng)l件為90℃3 min和95℃2 min時(shí)葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，分別為2.33 mg/g、2.31 mg/g。

2.6.2 95℃2 min處理后青菜的色澤指標(biāo) 在95℃下漂燙2 min后，青菜的色澤指標(biāo)如表5所示。

由表5和圖5可以看出，青菜采用95℃2 min的漂燙處理時(shí)，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為2.31 mg/g。色澤較好，-a*值為22.84，飽和度C*達(dá)到了35.56。

綜合以上過(guò)氧化物酶及多酚氧化酶活性測(cè)定的結(jié)果可得出，當(dāng)青菜95℃2 min燙漂后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻，過(guò)氧化物酶 （相對(duì)殘余活力8.53%）和多酚氧化酶（相對(duì)殘余活力1.24%）的活性均得到了很好的抑制，相對(duì)殘余活力低于10%，而且在此燙漂條件下青菜的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.31 mg/g）較高，色澤 （-a*值為22.84，飽和度C*為35.56）也比較好。

這樣不僅可以減少熱燙對(duì)青菜各項(xiàng)指標(biāo)的損失及組織的破壞，又可消除酶促褐變的隱患。

3 結(jié)語(yǔ)

較高的POD和PPO活性會(huì)導(dǎo)致酚類(lèi)化合物的降解，從而引起酶促褐變[12]。熱燙前處理的主要目的是殺死微生物和破壞酶的活性，防止水煮葉菜類(lèi)產(chǎn)品在保藏過(guò)程中變色、變味和營(yíng)養(yǎng)成分的損失，從而提高產(chǎn)品的保質(zhì)期[13-14]。

綜合以上測(cè)定的結(jié)果得出，當(dāng)青菜經(jīng)過(guò)95℃2 min燙漂后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻，過(guò)氧化物酶（相對(duì)殘余活力8.53%）和多酚氧化酶（相對(duì)殘余活力1.24%）的活性均得到了很好的抑制，相對(duì)殘余活力低于10%，而且在此燙漂條件下青菜的葉綠素含量（2.31 mg/g）較高，色澤（-a* 值為 22.84，飽和度C*為35.56）也比較好。因此確定，青菜熱燙前處理最佳的條件為95℃燙漂2 min后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴條件下冷卻。

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