尹春麗， 陶貴榮， 許 樂(lè)， 牛衛(wèi)寧*

（1.西安文理學(xué)院 生命科學(xué)系，陜西 西安710065；2.西北工業(yè)大學(xué) 生命學(xué)院，陜西 西安 710072）

S-腺苷甲硫氨酸合成酶 （S-adenosylmethionine synthetase）在體內(nèi)催化三磷酸腺苷和L-甲硫氨酸合成 S-腺苷甲硫氨酸 （S-adenosylmethionine，SAM）[1]，在歐美國(guó)家SAM已作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、保健品以及藥品而得到廣泛應(yīng)用[2]，但SAM售價(jià)昂貴。因此，建立廉價(jià)高效的SAM生產(chǎn)方法是其大規(guī)模推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，SAM的生產(chǎn)方法主要為酵母菌發(fā)酵法，菌種主要包括野生或者誘變的釀酒酵母，以及經(jīng)過(guò)遺傳改造的重組畢赤酵母，盡管發(fā)酵法SAM產(chǎn)量可以超過(guò)10 g/L[3-4]，但存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、底物轉(zhuǎn)化率低、純化工藝復(fù)雜、能耗高等不足[5]。體外酶促轉(zhuǎn)化法克服了發(fā)酵法的不足，同時(shí)生產(chǎn)成本較低，因而是較為有效的工業(yè)化生產(chǎn)方法。許多研究者對(duì)來(lái)源于釀酒酵母以及大腸桿菌的重組SAM合成酶的催化特性進(jìn)行了研究，但是存在SAM合成酶活性低、游離酶酶穩(wěn)定性差，以及無(wú)法回收重復(fù)利用的問(wèn)題[6-8]。作者所在研究組前期構(gòu)建了高效組成型表達(dá)SAM合成酶的重組大腸桿菌E.Coli JM109（pBR322-SAMS），重組菌SAM合成酶活性比原始菌提高了157倍，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究[9-10]。

與游離酶相比，固定化酶能大大提高催化反應(yīng)過(guò)程中酶的穩(wěn)定性。同時(shí)，固定化酶與反應(yīng)液可以通過(guò)離心或過(guò)濾等簡(jiǎn)單方式加以分離，有利于酶的多次重復(fù)使用及反應(yīng)產(chǎn)物的純化，更適于在工業(yè)生產(chǎn)中使用。Luo等[11]將來(lái)源于釀酒酵母的SAM合成酶通過(guò)親和層析固定在Ni離子螯和柱上，經(jīng)過(guò)3次連續(xù)反應(yīng)，固定化酶活力回收率僅為39.5%，該研究使用的固定化樹(shù)脂昂貴，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，而且固定化酶的活性回收率以及穩(wěn)定性并不理想。作者所在研究組通過(guò)海藻酸鈉包埋法固定化腺苷蛋氨酸合成酶，但是固定化酶活性回收率僅有42%，并且存在固定化酶在反應(yīng)過(guò)程中強(qiáng)度不高以及酶容易流失等問(wèn)題[12]。殼聚糖是一種富含氨基的天然高分子化合物，因其生物相容性、較好的機(jī)械性能、穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)而成為固定化酶的優(yōu)良載體，通過(guò)戊二醛交聯(lián)形成化學(xué)鍵將酶固定在殼聚糖微球上，可以防止催化過(guò)程中酶的流失。另外，作者所在研究組通過(guò)全細(xì)胞催化和固定化酶催化合成SAM的技術(shù)方法已經(jīng)獲得了專(zhuān)利授權(quán)[13]。

作者以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)SAM合成酶進(jìn)行固定化，分別對(duì)酶固定化條件以及固定化酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究，為工業(yè)化應(yīng)用固定化酶高效生產(chǎn)SAM奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑

重組大腸桿菌菌株 E.coli JM109（pBR322-SAMS）為作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[14]，Phenyl-Sepharose Fast Flow預(yù)裝柱購(gòu)于GE公司，SAM標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于 Sigma公司，殼聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量 6×105Da，脫乙酰度大于80%）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組SAM合成酶的表達(dá)和粗酶液制備 將重組菌 E.coliJM109（pBR322-SAMS）接種到 1 L含有15 μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，30℃220 r/min培養(yǎng)12～16 h，然后離心收獲菌體備用。重組SAM合成酶的純化主要參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，純化過(guò)程如下：離心1 L培養(yǎng)液收集細(xì)胞，然后用40 mL裂解液 （100 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA-Na2，pH 8.0）在冰水浴中超聲 （300 W，超聲 3 s，間隔 5 s）處理12 min破碎細(xì)胞，破碎液加入 （NH4）2SO4固體粉末至終濃度為0.75 mol/L，10 000 r/min離心20 min，上清液通過(guò)0.22 μm的濾膜過(guò)濾備用。將上述酶液加入經(jīng) Buffer A （Tris-HCl 50 mmol/L，（NH4）2SO40.75 mol/L，pH 8.0）預(yù)平衡的 Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，然后使用 Buffer B（Tris-HCl 50 mmol/L，pH 8.0）洗脫，收集酶液用于固定化酶制備。

1.2.2 SAM合成酶固定化方法 稱(chēng)取一定質(zhì)量的殼聚糖充分溶解于100 mL φ（乙酸）=2%的水溶液中，使用6號(hào)針頭注射器將該溶液逐滴加入到2 mol/L的NaOH水溶液中，殼聚糖溶液凝聚成直徑約為2 mm的白色微球，過(guò)濾收集并用蒸餾水洗滌至中性，然后在殼聚糖微球中加入不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛水溶液，室溫振蕩交聯(lián)5 h后用Tris-HCl緩沖液 （pH 8.0）洗滌交聯(lián)載體，然后加入適量的SAM合成酶液于4℃吸附交聯(lián)12 h，洗凈抽濾干燥后得到固定化酶，固定化酶密封保存于4℃。固定化酶的活力與固定化時(shí)所加游離酶總活力的比值即為固定化酶的活力回收率。

1.2.3 酶活性測(cè)定方法 固定化酶以及游離酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行，使用SAM標(biāo)準(zhǔn)品制作色譜峰峰面積和SAM質(zhì)量濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中SAM的質(zhì)量濃度。酶活力單位定義為：37℃，1 h催化形成1 μmol SAM所需要的酶量為1個(gè)活力單位（1 U）。

1.2.4 固定化酶催化合成SAM 用天平稱(chēng)取經(jīng)抽濾干燥的1 g固定化酶加到10 mL SAM合成反應(yīng)液 （100 mmol/L Tris、100 mmol/L KCl、70 mmol/L MgSO4、40 mmol/L L-Met、30 mmol/L ATP、0.8 mol/L對(duì)甲基苯磺酸鈉，pH 7.0）中，35℃振蕩反應(yīng)8 h，收集上清液進(jìn)行HPLC分析。每次反應(yīng)后，將固定化酶過(guò)濾洗滌后重復(fù)使用。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化條件的優(yōu)化

通過(guò)重組大腸桿菌組成型表達(dá)SAM合成酶，然后經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和疏水層析純化得到單位酶活為22 U/mg的SAM合成酶，結(jié)果如圖1所示，并將其用于后續(xù)的固定化酶研究。

2.1.1 殼聚糖微球的制備 殼聚糖溶液濃度能顯著影響殼聚糖成球性能。研究中首先考察了質(zhì)量濃度為1～5 g/dL殼聚糖溶液在2 mol/L的NaOH凝結(jié)液中的成球情況，結(jié)果表明：當(dāng)殼聚糖質(zhì)量小于2 g/dL的時(shí)候，殼聚糖黏度較小，成球容易，但是小球機(jī)械強(qiáng)度較差，在合成SAM的反應(yīng)液中易溶脹和破碎；當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度大于3 g/dL的時(shí)候，殼聚糖溶液成球困難。因此采用質(zhì)量濃度為2.5 g/dL殼聚糖溶液來(lái)制備殼聚糖微球。

2.1.2 戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響 平行取0.5 g殼聚糖微球，然后分別加入不同濃度的戊二醛水溶液5 mL，于室溫振蕩交聯(lián)5 h，抽濾洗滌。然后加入2 mL SAM酶液（2 mg/mL）于4℃交聯(lián)12 h，洗凈抽濾后得到固定化酶，測(cè)定固定化酶的活力。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)，酶活力達(dá)到最大。當(dāng)戊二醛含量較低時(shí)，載體表面偶聯(lián)的醛基不足，最終固定的酶量較少，導(dǎo)致固定化酶活性較低；當(dāng)戊二醛含量過(guò)高時(shí)，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同時(shí)載體結(jié)合過(guò)多的酶也增加了酶的空間位阻，使固定化酶的活力下降。由此可以確定戊二醛最佳體積分?jǐn)?shù)為0.8%。

圖1 SAM合成酶純化結(jié)果的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of SAM synthetase purification

圖2 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶的影響Fig.2 Effect of the concentration of glutaraldehyde on the immobilized enzyme

2.1.3 酶與載體配比對(duì)固定化的影響 平行取0.5 g殼聚糖微球與φ（戊二醛）=0.8%的水溶液交聯(lián)制備的載體，各加入不同量的酶液進(jìn)行固定化，測(cè)定固定化酶活力，結(jié)果如圖3所示。隨著給酶量的增加，固定化酶活力逐漸增加。當(dāng)酶量增加到6 mg/mL時(shí)，固定化酶活力達(dá)到最大值。繼續(xù)增加酶量，固定化酶活力不再增加，并且有略微下降的趨勢(shì)，這是由于載體的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到飽和。因此確定1 mL凝膠添加6 mg SAM合成酶為最佳。

圖3 酶與凝膠配比對(duì)固定化酶的影響Fig.3 Effect of enzyme/chitosan gel ratio on the immobilized enzyme

2.1.4 交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶固定化的影響 為了減少酶交聯(lián)過(guò)程中活性的損失，載體和酶的交聯(lián)反應(yīng)在4℃下進(jìn)行。交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響如圖4所示。固定化酶活力隨著酶交聯(lián)時(shí)間增加而增大，12 h達(dá)到最高后則略微下降，酶交聯(lián)時(shí)間越長(zhǎng)越有利于酶分子固定在載體上，但當(dāng)載體偶聯(lián)的酶過(guò)多時(shí)，可能使載體孔徑相應(yīng)變小，導(dǎo)致底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)性降低，從而使酶活力下降。

圖4 酶交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of cross-linking time on the immobilized enzyme

在以上優(yōu)化條件下，所得固定化酶活性回收率為76%。

2.2 固定化SAM合成酶的性質(zhì)

2.2.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性 將固定化酶和游離酶分別在不同溫度下保溫5 h后測(cè)定殘留酶活力，分別以未經(jīng)過(guò)熱處理的固定化酶和游離酶的酶活力為100%，結(jié)果如圖5所示。固定化酶的熱穩(wěn)定性比游離酶明顯提高，固定化酶在55℃下保溫5 h后仍保持了53%的活力，而游離酶在50℃下保溫5 h，活力完全喪失。另外，作者所在研究組前期通過(guò)海藻酸鈉包埋法制備了固定化SAM合成酶，在55℃下保溫5 h后保持了32%的活力[12]，因此通過(guò)殼聚糖交聯(lián)法制備的固定化酶熱穩(wěn)定性高于海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶。這可能是由于SAM合成酶被戊二醛交聯(lián)固定化后增加了酶分子的穩(wěn)定性，使分子整體運(yùn)動(dòng)受限，酶的熱穩(wěn)定性也隨之增加。

圖5 固定化和游離SAM合成酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of immobilized and free SAM synthetase

2.2.2 pH對(duì)固定化酶活力的影響 將固定化酶和游離酶置于pH 6～9.5的緩沖液中4℃放置10 h測(cè)定酶活性，結(jié)果如圖6所示，在更廣泛的pH范圍內(nèi)固定化酶比游離酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)，特別是在pH＞7.5的堿性條件下固定化酶的穩(wěn)定性得到大幅度提高。在pH 7.5～9.0的緩沖液中4℃保溫10 h酶活性仍保留80%以上，可能是酶經(jīng)過(guò)交聯(lián)后被固定在凝膠結(jié)構(gòu)中，使外界因素對(duì)酶的影響減弱。但是固定化酶和游離酶在酸性條件下的穩(wěn)定性較差，因此在溶液狀態(tài)下保存SAM合成酶需要選擇堿性緩沖液系統(tǒng)。

圖6 pH對(duì)固定化和游離SAM合成酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of pH on the immobilized and free SAM synthetase

2.2.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性 將1 g固定化酶與10 mL反應(yīng)液在35℃下連續(xù)反應(yīng)5批次，每次反應(yīng)時(shí)間為8 h，每次反應(yīng)后分別測(cè)定殘余酶活力，以第1批次反應(yīng)交聯(lián)固定化酶的總活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖7所示。在第1批次反應(yīng)后固定化酶活力有一定程度的下降，殘余酶活為91%，連續(xù)反應(yīng)5批次后酶活力仍然保持64%，固定化酶活性的降低可能是載體表面部分酶分子的脫落以及部分固定化酶變性失活所致。同時(shí)經(jīng)過(guò)5批次反應(yīng)后，固定化酶的形態(tài)沒(méi)有明顯變化。在底物三磷酸腺苷（ATP）濃度為30 mmol/L的條件下，固定化酶催化底物ATP的轉(zhuǎn)化率仍超過(guò)95%，說(shuō)明固定化SAM合成酶具有較好的操作穩(wěn)定性以及催化活性。

圖7 固定化酶的重復(fù)使用性Fig.7 Repeated usability of the immobilized enzyme

2.2.4 固定化酶的貯存穩(wěn)定性 分別將抽濾的固定化酶和游離酶（pH 7.5）置于4℃冰箱中，貯存15 d后測(cè)殘余酶活，游離酶活性?xún)H殘余17%，而固定化酶保存了78%的酶活性，說(shuō)明固定化酶有較好的貯存穩(wěn)定性。用于固定化的SAM合成酶是經(jīng)過(guò)一步純化的粗酶，所以游離酶溶液中含有各種蛋白酶，在溶液長(zhǎng)期貯存過(guò)程中容易降解，而通過(guò)戊二醛交聯(lián)的固定化酶蛋白空間構(gòu)象受到限制，所以穩(wěn)定性較高。

3 結(jié)語(yǔ)

殼聚糖是最常用的天然高分子固定化酶載體，通過(guò)戊二醛交聯(lián)將酶固定在殼聚糖微球上，大大提高了SAM合成酶的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，最佳固定化條件為：殼聚糖質(zhì)量濃度為2.5 g/dL、戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.8%、固定化酶量為6 mg/mL、固定化時(shí)間為12 h。固定化酶熱穩(wěn)定性得到大幅度提高，同時(shí)固定化酶具有較好的強(qiáng)度和操作穩(wěn)定性，將固定化酶用于SAM的催化合成，連續(xù)反應(yīng)5批次后，酶活性仍保留64%，固定化酶催化底物ATP的轉(zhuǎn)化率超過(guò)95%。研究成果為固定化酶法生產(chǎn)SAM奠定了基礎(chǔ)。

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