張以忠， 李 晶， 鄧琳瓊

（畢節(jié)學(xué)院 地理與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 畢節(jié)551700）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指生物體內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生或在外界物理化學(xué)因素誘導(dǎo)下產(chǎn)生含有氧原子且氧化能力很強(qiáng)的多種物質(zhì)的總稱[1-3]。主要有超氧陰離子自由基（·O2-）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）等[4-7]。 正常情況下，人體內(nèi)的自由基是處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中，確保機(jī)體有效、正常的生命活動。但如果自由基在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過多或清除過慢，均會通過攻擊生命大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞，造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平上的各種損傷，加速機(jī)體衰老并誘發(fā)各種疾病[8-10]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類長期攝入一定量的抗氧化物質(zhì)能有效地降低心腦血管疾病和癌癥發(fā)病率[11-12]。由于一些人工化學(xué)合成的抗氧化劑可能具有一定的毒副作用，以及人們越來越追求綠色環(huán)保消費，因此，從日常食物中尋找天然的抗氧化劑具有重要意義。

甜 蕎 （F.esculentum Moench）屬 于 蓼 科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）[13]。 在中國和世界上許多國家廣泛種植，果實較大，呈三棱形，表面光滑，食用品質(zhì)較好，含有多種易被人體吸收的礦物質(zhì)元素和人體所必需的8種氨基酸，非常接近人體需要14-15]。另外，它還含有其它谷物中沒有的較為豐富的生物活性成分黃酮類化合物[16-18]。甜蕎雖然屬藥食兩用植物，但對其抗氧化活性的研究報道極少。何永艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)，甜蕎不同生育期地上部分乙醇提取液對·OH有一定的清除作用，且與生育期有關(guān)。但植物的不同器官對活性氧的清除作用有所不同[20]。而且有關(guān)甜蕎根、莖、葉和花抗氧化活性的研究還未見報道。因此，作者利用體外法，研究了甜蕎不同器官（根、莖、葉和花）水提液抗·OH、·O2-和H2O2的能力，篩選高抗氧化活性的甜蕎器官，為對其深入研究及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為貴州畢節(jié)甜蕎，來源于畢節(jié)學(xué)院地理與生命科學(xué)學(xué)院蕎麥種子資源庫。

1.2 儀器與試劑

723N可見分光光度計，上海精科產(chǎn)品；電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；雙功能水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇億通電子有限公司產(chǎn)品。

NBT為amresco公司產(chǎn)品；L-MET、核黃素為國產(chǎn)生化試劑，番紅花紅T為國產(chǎn)生物染色素，

EDTANa2、FeSO4·7 H2O、H2O2、EDTA、NaCl、KCl、Na2HPO4（無水）、KH2PO4、NaOH、（NH4）2MoO4均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 蕎麥種子從低溫冰柜中取出，于2012年3月將其播種于貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)鴨池鎮(zhèn)試驗田，盛花期時分別取其根、莖、葉和花，用蒸餾水洗凈，40℃下恒溫烘干至恒重，將其打粉，分別加干重15倍蒸餾水，80℃下恒溫振蕩 （140 r/min）1 h，過濾收集濾液，殘渣再加5倍蒸餾水，80℃恒溫振蕩（140 r/min）1 h，過濾收集濾液，合并兩次濾液即為甜蕎各器官水提取液（質(zhì)量濃度分別為 27.0、80.0、29.4 和 61.5 mg/mL），將其儲存冰箱備用。

1.3.2 水提液對活性氧的清除測定

1）甜蕎各器官水提液對·OH的清除試驗：參照文獻(xiàn)[20]的方法，稍加改動。每種樣品（根、莖、葉和花）均設(shè) 5 個質(zhì)量濃度梯度（0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mg/mL），分別測定各器官在各質(zhì)量濃度下的清除率。反應(yīng)體系總體積為3 mL，包含pH=7.4的PBS 0.75 mL、2 mmol/L 的 EDTANa2-Fe （Ⅱ）1 mL，70 μg/mL的番紅花紅T 0.5 mL，不同濃度供試液0.25 mL和體積分?jǐn)?shù)0.33%的H2O20.5 mL。將其充分混勻，置37℃恒溫水浴鍋中保溫30 min后，用723 N分光光度計于520 nm處測吸光度值（A），加不同濃度供試液的體系其吸光度為A樣品，以提取介質(zhì)代替供試液的體系其吸光度為A空白，兩者均以未加 EDTANa2-Fe（II）（用蒸餾水代替）作對照，各自與其對照之差分別記為 ΔA樣品和 ΔA空白。 供試液對·OH的清除能力以清除率E（%）表示，清除率按下式計算：

以提取液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

2）甜蕎各器官水提液對·O2-的清除試驗：參照文獻(xiàn)[20]的方法，并稍加改動。每種樣品（根、莖、葉和花）均設(shè) 5 個質(zhì)量濃度梯度（0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/mL），分別測定各器官在各質(zhì)量濃度下的清除率。反應(yīng)體系總體積為3.25 mL，包含不同濃度提取液 0.25 mL，14.5 mmol/L的 L-Met 2.7 mL，3.0 mmol/L 的 EDTA 0.1 mL，2.25 mmol/L的 NBT 0.1 mL，60 μmol/L 的核黃素 0.1 mL（EDTA、NBT、核黃素均以50 mmol/L pH 7.8的PBS配制）?；靹虻谷胛舛纫恢碌谋壬螅? 000 lx下光照10 min，反應(yīng)后立即避光，迅速顛倒混勻，立即在560 nm下測吸光度值。加不同濃度供試液的體系為A樣品，以提取介質(zhì)代替供試液的體系為A對照，均以PBS代替NBT作空白。樣品管和對照管吸光度與各自空白之差分別記為 ΔA樣品和 ΔA對照。 供試液對·O2-的清除能力以清除率E（%）表示，清除率計算式：

以提取液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

3）甜蕎各器官水提液對H2O2的清除試驗：參照文獻(xiàn)[21]的方法，并稍加改動。具體方法如下：每種樣品（根、莖、葉和花）均設(shè)5個質(zhì)量濃度梯度（0.31、0.62、0.93、1.24、1.55 mg/mL），分別測定各器官在各質(zhì)量濃度下的清除率。反應(yīng)體系總體積為3.25 mL，在樣品管中加入0.25 mL不同濃度的樣品，然后放入37℃水浴鍋，迅速加入1.5 mL基質(zhì)液[60 mmol/L的 PBS（pH=7.4）含 65 μmol/L 的 H2O2]作為樣品對照組，保溫1.5 min后立即加入32.4 mmol/L的鉬酸銨溶液1.5 mL，自來水中終止反應(yīng)5 min，405 nm處測吸光度值（A）。以提取介質(zhì)代替供試液作對照，均以PBS代替基質(zhì)液作空白，樣品管和對照管吸光度與各自空白之差分別記為ΔA樣品和ΔA對照。清除率按下式計算：

以提取液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 利用Excel2003和SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蕎各器官水提液對·OH的清除作用

甜蕎各器官水提液對·OH的清除作用見圖1。

圖1 甜蕎各器官提取液對·OH的清除作用Fig.1 Scavenging of·OH by extractions from various organs of F.esculentum

由圖1知，甜蕎根、莖、葉和花水提液對·OH均有清除作用，莖和花水提液在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的清除率變化較大，而葉和根水提液對·OH的清除率變化較小。表明莖和花水提液隨質(zhì)量濃度升高對·OH的清除率逐漸升高，而葉和根水提液對·OH的清除率受質(zhì)量濃度影響較小。各器官水提液對·OH清除能力強(qiáng)弱依次為莖＞花＞葉＞根。多重比較見表1。

表1 甜蕎各器官提取液清除·OH多重比較Tab.1 Multiple comparison of scavenging of·OH by extractions from various organs of F.esculentum

從表1可知，莖和花水提液對·OH的清除率差異不顯著，但均極顯著高于葉和根水提液。而葉和根水提液之間差異不顯著。在0.01水平上對·OH的清除率大小排序為：莖、花＞葉、根。

2.2 甜蕎各器官水提液對·O2-的清除作用

甜蕎各器官水提液對·O2-的清除作用見圖2。

圖2 甜蕎各器官提取液對·O2-的清除作用Fig.2 Scavenging of·O2-by extractions from various organs of F.esculentum

由圖2知，甜蕎根、莖、葉和花水提液對·O2-均有清除作用，隨質(zhì)量濃度升高清除率逐漸增加。各器官水提液對·O2-清除能力強(qiáng)弱依次為花＞葉＞莖＞根。多重比較見表2。

表2 甜蕎各器官提取液清除·O2-多重比較Tab.2 Multiple comparison of scavenging of·O2-by extractions from various organs of F.esculentum

由表2知，花水提液對·O2-的清除率極顯著高于莖和根水提液，顯著高于葉水提液。葉和莖水提液之間差異不顯著，但兩者分別極顯著和顯著高于根水提液對·O2-的清除率。在0.05水平上對·O2-的清除率大小排序為：花＞葉、莖＞根。

2.3 甜蕎各器官水提液對H2O2的清除作用

甜蕎各器官水提液對H2O2的清除作用見圖3。

圖3 甜蕎各器官提取液對H2O2的清除作用Fig.3 Scavenging of H2O2by extractions from various organs of F.esculentum

由圖3知，葉和花水提液對H2O2的清除率相對較高，且二者均隨質(zhì)量濃度的增加逐漸升高，而根和莖水提對H2O2的清除率相對較低，且隨質(zhì)量濃度升高變化不大。各器官水提液對H2O2清除能力強(qiáng)弱依次為葉＞花＞根＞莖。多重比較見表3。

表3 甜蕎各器官提取液清除H2O2多重比較Tab.3 Multiple comparison of scavenging of H2O2by extractions from various organs of F.esculentum

從表3可看出，葉和花水提對H2O2的清除率無顯著差異，但均極顯著高于根和莖。而根和莖水提液之間對H2O2的清除率差異不顯著。在0.01水平上清除率大小排序為：葉、花＞根、莖。

3 討論

自由基對人體危害很大，其具有高度的活潑性和極強(qiáng)的氧化能力，人體內(nèi)過量的自由基會造成組織細(xì)胞中生物大分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞性變化，體內(nèi)羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）和過氧化氫（H2O2）等活性氧過量會使機(jī)體受到損傷，從而引起癌癥、衰老、心血管疾病等慢性病[9-10]。正常情況下，機(jī)體含有自由基清除劑，可以清除一定量的自由基。但當(dāng)自由基過多，造成機(jī)體紊亂時，必須尋找外源性自由基清除劑——抗氧化劑，讓其清除機(jī)體內(nèi)過多的自由基，是減少癌癥、衰老、心血管疾病等對人類健康威脅的有效手段之一[22]。由于一些人工化學(xué)合成的抗氧化劑可能具有一定的毒副作用，因此，從日常食物中尋找天然的抗氧化劑具有重要意義。

甜蕎因種植適應(yīng)性強(qiáng)，并含有黃酮、蛋白質(zhì)、原花青素、膳食纖維等功效分子，具有降糖、抗缺血、抗菌、抗癌、助睡眠等保健功能，屬于藥食兩用植物[14，16，23]，因此越來越受到人們的重視。 目前有關(guān)蕎麥抗氧化活性的研究報道很少。何永艷等[19]研究了甜蕎不同生育期（出苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期、灌漿期、收獲期）地上部分乙醇提取液對·OH的清除作用，發(fā)現(xiàn)：甜蕎地上部分乙醇提取液對·OH均有清除作用，隨生育期推進(jìn)，對羥基自由基清除率先增大，到盛花期達(dá)到最大，以后逐漸下降，在苗期和收獲期，甜蕎提取液幾乎對羥基自由基沒有清除作用。作者首次對甜蕎盛花期不同器官水提液清除活性氧（·OH、·O2-和 H2O2）作研究，發(fā)現(xiàn)：甜蕎根、莖、葉和花水提液對·OH、·O2-和H2O2均有清除作用，但存在一定的差異。清除·OH中，莖和花隨提取液質(zhì)量濃度升高清除率逐漸增加，而葉和根水提液的清除率受質(zhì)量濃度影響較小。且莖和花水提液的清除率差異不顯著，但均極顯著高于葉和根水提液。而葉和根水提液之間差異不顯著。清除·O2-中，根、莖、葉和花隨提取液質(zhì)量濃度升高清除率逐漸增加，但各器官之間的清除作用存在一定的差異，花水提液的清除率極顯著高于莖和根水提液，顯著高于葉水提液。葉和莖水提液之間差異不顯著，但兩者均顯著高于根水提液的清除率，且葉和根水提液之間的差異達(dá)到極顯著水平。清除H2O2中，葉和花水提液的清除率相對較高，且二者均隨質(zhì)量濃度升高逐漸增加，而根和莖水提液的清除率相對較低，且隨質(zhì)量濃度升高清除率變化不大。多重比較表明，葉和花水提液對自由基的清除率無顯著差異，但均極顯著高于根和莖水提液。而根和莖水提液之間差異不顯著。綜合以上分析發(fā)現(xiàn)，甜蕎的花水提液對·OH、·O2-和H2O2均具有較高的清除作用，花是清除活性氧制劑的較好器官。而根是清除活性氧制劑的較差器官。因此本研究可為深入探討甜蕎不同器官的抗氧化機(jī)理和合理開發(fā)利用甜蕎資源提供一定參考。但甜蕎在苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期、灌漿期和收獲期各器官提取液對·OH、·O2-和H2O2的清除作用與何永艷等[19]報道是否一致有待進(jìn)一步研究。

另外，甜蕎中成分復(fù)雜，并含有糖類、蛋白質(zhì)、黃酮、酚類、原花青素、膳食纖維等多種功效分子，這些功效分子均有抗氧化作用。因此甜蕎各器官水提液的可能成分以及可能起到抗氧化作用的具體成分是什么等都有待作進(jìn)一步研究。

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