王 軍， 雷楗勇， 陳 蘊， 金 堅

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

Oct4是維持胚胎干細胞自我更新和多潛能性 的重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，被廣泛應(yīng)用于細胞重編程，形成了具有類似胚胎干細胞性質(zhì)的誘導(dǎo)多功能干細胞 IPS（induced pluripotent stem cells）[1-3]。目前，由不同量組合的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等轉(zhuǎn)錄因子形成的細胞重編程技術(shù)，主要采用病毒包裝轉(zhuǎn)染的方式將轉(zhuǎn)錄因子整合入細胞中[4-5]。由于病毒載體轉(zhuǎn)染效率和整合位點的差異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子無法準確定量干預(yù)。作者利用細胞穿膜肽TAT可高效介導(dǎo)蛋白進入細胞的特征[6-7]，設(shè)計和生物制備TATOct4融合蛋白，并評價其穿透細胞的能力。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達8 h。8 000 r/min冷凍離心收集菌體，超聲破碎，離心分離上清與沉淀，進行SDS-PAGE分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及細胞 TAT-Oct4基因、pET28a表達載體、BL21（DE3）原核表達菌株、NIH 3T3細胞，均由作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 Pfu DNA聚、Nco I、Xho I限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，均購自Fermentas公司；膠回收試劑盒、IPTG、卡那霉素，購于上海生工生物工程股份有限公司；Anti-6*His一抗，購自Abcam公司；Alexa Fluor 488熒光標記的二抗，購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 TAT-Oct4目的基因的克隆 設(shè)計含Nco I和Xho I上下游引物，引物序列如下：

上游引物：5'-CATGCCATGGCAATGCATCATC ATCATCATCATTCTTC-3'

下游引物：5'-CCGCTCGAGCGGTCAGTTTGAA TGCATGGGAGAGC-3'

以TAT-Oct4基因為模板，經(jīng)PCR擴增目的基因，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 2 min， 循環(huán) 30次；72℃延伸 10 min；最后4℃保存。

1.2.2 pET28a-TAT-Oct4表達載體的構(gòu)建 將PCR擴增獲得TAT-Oct4基因與pET28a空載體分別用Nco I與Xho I雙酶切，經(jīng)膠回收后，在T4連接酶作用下連接轉(zhuǎn)化入DH5α菌株，挑取單菌落，經(jīng)雙酶切驗證后，送至上?！吧ぁ边M一步測序驗證。pET28a-TAT-Oct4重組表達載體如圖1所示。1.2.3 融合蛋白TAT-Oct4的表達鑒定 將測序正確重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21（DE3）獲得重組表達菌株，挑取單菌落接種到含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，當OD值達到0.6，

圖1 重組表達載體pET28a-TAT-Oct4圖譜Fig. 1 Schematic description of recombinant expression plasmid pET28a-TAT-Oct4

1.2.4 包涵體洗滌、純化及復(fù)性 表達產(chǎn)物分別經(jīng)洗滌液緩沖 I（50 mmol/L的 Tris-HCl，300 mmol/L的Nacl，質(zhì)量分數(shù)1%的TritonX-100，2 mmol/L的尿素，pH 8.0）和洗滌緩沖液 II（50 mmol/L的 Tris-HCl，300 mmol/L 的 Nacl，2 mol/L 的尿素，pH 8.0）洗滌后，在變性緩沖液（50 mmol/L的Tris-HCl，8 mol/L的尿素，300 mmol/L的 NaCl，25 mmol/L的咪唑，pH 8.0）中溶解TAT-Oct4包涵體。在變性條件下，利用Ni-NTA sepharose純化，純化條件為：上樣緩沖液 A（50 mmol/L 的 Tris HCl，8 mol/L 的尿素，300 mmol/L 的 NaCl，25 mmol/L 的咪唑，pH 8.0）和洗脫緩沖液B （50 mmol/L的Tris HCl，8 mol/L的尿素，300 mmol/L 的 NaCl，250 mmol/L 的咪唑，pH 8.0）分段洗脫收集各洗脫峰進行SDS-PAGE分析。將純化獲得TAT-Oct4重組蛋白經(jīng)尿素梯度透析（4，2，1，0.5，0 mol/L 的 尿 素 ，50 mmol/L 的 Tris-HCl，100 mmol/L的NaCl，質(zhì)量分數(shù) 10%的甘油，300 mmol/L的精氨酸，2 mmol/L的GSH/0.2 mmol/L的 GSSG，1 mmol/L 的 EDTA，0.2 mmol/L 的 PMSF，pH 8.0）復(fù)性，最后用PBS透析3次除去其它小分子，獲得具有活性的TAT-Oct4目的蛋白質(zhì)。

1.2.5 細胞免疫熒光 NIH 3T3細胞培養(yǎng)于含質(zhì)量分數(shù)10%的FBS的DMEM培養(yǎng)液，待細胞貼壁24 h后，加入TAT-Oct4目的蛋白共培養(yǎng)6h。細胞經(jīng)預(yù)冷的細胞固定液（體積分數(shù)95%的乙醇和質(zhì)量分數(shù)5%的乙酸）固定10 min后，用含質(zhì)量分數(shù)0.2%的TritonX-100的PBS室溫下穿透細胞膜15 min。經(jīng)PBS漂洗及封閉處理后，加入Anti-6*His一抗（稀釋比例1∶250），4℃過夜孵育。PBS洗滌后，加入相應(yīng)的Alexa Fluor 488熒光標記的二抗（稀釋比例1∶500）室溫處理1 h。細胞核經(jīng)DAPI復(fù)染定位后，在Nikon TE 2000型熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的基因TAT-Oct4擴增及構(gòu)建

PCR擴增TAT-Oct4目的基因經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1.5%DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，可見其相對分子質(zhì)量大小與理論值1 158 bp接近，如圖2所示。獲得的重組表達質(zhì)粒pET28a-TAT-Oct4經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切，可形成約有5 300 bp的載體片段和1 158 bp的TAT-Oct4目的基因片段（見圖3），結(jié)果與理論值相符。重組質(zhì)粒送至上?！吧ぁ睖y序，其測序結(jié)果與理論序列完全一致。

圖2 TAT-Oct4基因的擴增結(jié)果Fig.2 Result of TAT-Oct4 amplification

圖3 重組質(zhì)粒pET28a-TAT-Oct4雙酶切驗證Fig.3 Double digestion result of recombinant plasmid pET28a-TAT-Oct4

2.2 融合蛋白TAT-Oct4表達產(chǎn)物鑒定

含有pET28a-TAT-Oct4宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)15%SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量約45 kDa處有特異性蛋白條帶，與理論值相符（見圖4）。超聲破碎后，分離收集上清與沉淀分別進行SDS-PAGE分析，可以看到沉淀中含有大量目的蛋白質(zhì)（見圖5），由此可見目的蛋白質(zhì)主要以包涵體形式表達。

圖4 融合蛋白TAT-Oct4表達SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of TAT-Oct4 fusion protein expression in E.coli

圖5 TAT-Oct4破碎上清與沉淀SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of TAT-Oct4 supernatant and pellets after lysis

2.3 TAT-Oct4純化及復(fù)性收率

在分子設(shè)計時，上游引物引入His標簽，方便目的蛋白質(zhì)使用鎳離子親和柱進行分離純化。TATOct4重組蛋白質(zhì)在變性條件下，經(jīng)鎳柱分段洗脫后，洗脫收集峰進行質(zhì)量分數(shù)15%SDS-PAGE分析，如圖6所示，在100 mmol/L咪唑洗脫條件下（泳道6與7），可獲得純度90%以上的目的蛋白質(zhì)。同時也可觀察到，整個純化過程中雜蛋白相對較少，說明包涵體經(jīng)洗滌后，其純度已經(jīng)相對較高。研究表明，在包涵體復(fù)性過程中，降低蛋白質(zhì)初始濃度和化學(xué)添加劑如甘油，可有效減少蛋白質(zhì)分子之間的聚集，從而提高復(fù)性收率[8]。同時對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，引入氧化還原體系GSH/GSSG能促進蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中正確折疊[9]。作者采用尿素梯度透析復(fù)性，同時加入促進復(fù)性的化學(xué)添加物，最終TAT-Oct4平均收率8.8%，同時可觀察到復(fù)性蛋白初始濃度越高，其收率越低，見表1。

圖6 TAT-Oct4純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of TAT-Oct4 after purification

表1 TAT-Oct4復(fù)性收率Table 1 Refolding filed of TAT-Oct4 using urea gradient dialysis

2.4 TAT介導(dǎo)Oct4穿透細胞能力

細胞穿膜肽（cell penetrating peptides）是一類富含精氨酸或賴氨酸[10]，并且能將大分子物質(zhì)攜帶到細胞胞漿甚至細胞核內(nèi)部的一類短肽[11]。常用的有TAT（YGRKKRRQRRR）和人工合成的多聚精氨酸或賴氨酸。作者在Oct4的N端引入細胞穿膜肽TAT介導(dǎo)其快速進入細胞。NIH 3T3與重組蛋白TAT-Oct4（終質(zhì)量濃度 6 μg/mL）共培養(yǎng) 6 h 后，在熒光顯微鏡下觀察，近100%的細胞含有TAT-Oct4融合蛋白，并集中分布于細胞核內(nèi)（如圖7（b））。對照組（圖 7（a））加入相應(yīng)的熒光標記二抗。

圖7 TAT-Oct4穿透細胞免疫熒光分析Fig.7 ImmunocytochemistryanalysisofTAT-Oct4 penetrating cells

3 結(jié)語

誘導(dǎo)多功能干細胞的產(chǎn)生，避開了干細胞倫理和免疫排斥兩大難題[12]，然而利用病毒技術(shù)獲得的誘導(dǎo)多功能干細胞具有致瘤的風(fēng)險，因此限制其臨床應(yīng)用[13-14]。作者成功構(gòu)建并制備了TAT-Oct4融合蛋白，鎳柱純化后，其純度高達90%。通過尿素梯度透析復(fù)性的方法，TAT-Oct4的平均收率為8.8%。同時驗證了細胞穿膜肽TAT能高效地將Oct4轉(zhuǎn)導(dǎo)進細胞內(nèi)，為建立蛋白質(zhì)誘導(dǎo)IPS奠定了基礎(chǔ)。然而TAT-Oct4在大腸桿菌中的表達主要以包涵體形式存在，其可溶性表達有待進一步摸索與改造。

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