馬 萍，閆玉文，包春雨

隨著過敏性疾病的日趨增多，其發(fā)生與環(huán)境的關(guān)系日益受到重視［1］。雖然哮喘發(fā)病率增高的原因較為復(fù)雜，但相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，環(huán)境與個(gè)人衛(wèi)生水平與過敏性疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)［2］，與寄生蟲、細(xì)菌或病毒的感染率降低有關(guān)，現(xiàn)代都市化生活降低了感染寄生蟲和微生物的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受病原體刺激減少，可能會(huì)引起免疫系統(tǒng)發(fā)育的改變及炎性因子失控表達(dá)［3］。過敏性哮喘的發(fā)病是否與蠕蟲感染有關(guān)，多位研究者的結(jié)果并不盡相同。Flohr 等［4］發(fā)現(xiàn)鉤蟲感染可降低哮喘的發(fā)生，Smits等［5］研究提示曼氏血吸蟲感染對(duì)氣道炎性反應(yīng)具有保護(hù)作用，而Pinelli 等［6］認(rèn)為，犬弓蛔蟲感染加重過敏性氣道炎性反應(yīng)。研究結(jié)果的迥異，提示可能不同的蠕蟲感染對(duì)變態(tài)反應(yīng)呈現(xiàn)不同的作用，同時(shí)也可能有多種因素會(huì)影響兩者間的關(guān)系［7］。

旋毛蟲感染對(duì)過敏性哮喘的作用機(jī)制目前尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)以BALB/c 小鼠為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，首先建立旋毛蟲感染小鼠模型，在此基礎(chǔ)上以O(shè)VA 誘發(fā)小鼠過敏性哮喘，通過測(cè)定單純過敏性哮喘鼠和旋毛蟲感染后哮喘鼠血清中總IgE、IL-4 及IL-5 水平變化，觀察旋毛蟲感染對(duì)過敏性哮喘的影響，并初步探討其可能的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雌性BALB/c 小鼠20只，8周齡，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。隨機(jī)分為4組，每組5 只，Ⅰ組為空白對(duì)照組，Ⅱ組為單純過敏性哮喘組，Ⅲ組為感染旋毛蟲并發(fā)哮喘組。Ⅳ組為單純感染旋毛蟲組。

1.1.2 主要試劑 卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)(美國Sigma 公司生產(chǎn)，Ⅱ級(jí));TIgE、IL-4、IL-5 ELISA 檢測(cè)試劑盒(美國R＆D Systems 公司生產(chǎn));胃蛋白酶(Pepsin，北京奧博星生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器 電子天平(AG204 DeltaRange，瑞士Mettler Toledo)，生物顯微鏡(Olympus，日本)，超低溫冰箱(Sanyo，日本)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(DG3022A，南京華東實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠模型 Ⅰ組小鼠不做任何處理，與其他組小鼠同條件飼養(yǎng)，自由飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)，室溫20～26℃。

1.2.1.1 建立旋毛蟲感染模型 Ⅲ、Ⅳ組小鼠建立旋毛蟲感染模型，方法如下:(1)絞碎含有旋毛蟲囊包幼蟲的小鼠肌肉，放置于含有人工消化液(100 ml 蒸餾水+1 g 胃蛋白酶+0.8 ml 鹽酸)的燒杯中，肉樣與消化液的比例為1∶30(W/V)，充分?jǐn)嚢杈鶆?(2)放37℃溫箱中，經(jīng)10～18 h 充分消化后(期間經(jīng)常攪拌)，將上層液及漂浮物小心倒掉，加生理鹽水洗滌3次，過濾;(3)幼蟲沉淀物加3%明膠生理鹽水調(diào)勻，每只小鼠經(jīng)灌胃法感染200～300 條。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Ⅲ、Ⅳ組小鼠均取取腓腸肌壓片鏡檢，低倍鏡下可見肌纖維內(nèi)卷曲的旋毛蟲囊包幼蟲，即為旋毛蟲感染模型成功。

1.2.1.2 建立過敏性哮喘模型 Ⅲ組感染旋毛蟲28 d 后和未作任何處理的Ⅱ組小鼠，建立哮喘動(dòng)物模型。(1)1 mg OVA 溶于2 ml PBS 中，吹打混勻;(2)加2 ml 10% KAL(SO4)2，充分混勻;(3)逐滴將10 mol/L NaOH 加入到上述混合液中，調(diào)整pH值為6.5;(4)室溫孵育60 min 后，2500 r/min，離心5 min，棄上清，加PBS 使其終體積為2 ml，輕輕吹打混勻;(5)每只小鼠腹腔注射200 μl OVA 混懸液，其中含有OVA 100 μg，KAL(SO4)22 mg;(6)第14天重復(fù)上述操作;(7)第21～27 天，連續(xù)7 d，用乙醚麻醉小鼠后，鼻內(nèi)滴入50 μl 含50 μg OVA 的PBS 混懸液進(jìn)行致敏激發(fā)。激發(fā)后Ⅱ組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、節(jié)律不整，點(diǎn)頭呼吸，煩躁不安，二便失禁、發(fā)紺等現(xiàn)象，Ⅲ組小鼠略有呼吸急促、節(jié)律不整現(xiàn)象，無明顯煩躁、發(fā)紺現(xiàn)象。

1.2.2 血清的收集處理 56 d 后，摘取小鼠眼球取血，4℃冰箱靜置過夜，3 000 r/min，離心10 min，移液器小心吸取上清液置凍存管-20℃冰箱保存，待檢。

1.2.3 檢測(cè)步驟 嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS18 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)均用±s 表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與Ⅱ組相比較，Ⅲ組血清TIgE 水平降低(P＜0.05);與Ⅱ組相比較，Ⅲ組血清IL-4 水平降低(P＜0.05);與Ⅱ組相比較，Ⅲ組血清IL-5 水平降低(P＜0.05)。見表1 。

表1 小鼠血清TIgE、IL-4 及IL-5 水平 (，n=5)

表1 小鼠血清TIgE、IL-4 及IL-5 水平 (，n=5)

注:與Ⅰ組比較，①P＜0.05;與Ⅱ組比較，②P＜0.05

3 討 論

過敏性哮喘是一種氣道慢性非特異性炎性反應(yīng)性疾?。?］，它與非過敏性哮喘的主要區(qū)別在于體內(nèi)IgE 水平不同。IgE 被認(rèn)為是介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)的重要介質(zhì)，促使嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils，Eos)向局部游走，導(dǎo)致呼吸道平滑肌收縮、黏膜水腫、分泌物增加、管腔狹窄等一系列反應(yīng)。而IL-4 是Th2細(xì)胞分泌的促進(jìn)IgE 合成的最主要細(xì)胞因子，與IgE水平升高呈顯著正先關(guān)，可使靜止B 細(xì)胞表達(dá)FcεR，輔助變應(yīng)原特異性B 淋巴細(xì)胞增殖分化，并通過IgE 類別轉(zhuǎn)換等機(jī)制產(chǎn)生變應(yīng)原特異性IgE，還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖分化，同時(shí)也是肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子。過敏性哮喘以自分泌方式促進(jìn)Th2 細(xì)胞分化，抑制Th1 細(xì)胞增殖及其應(yīng)答;增加血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)的表達(dá)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素，促進(jìn)氣道炎性反應(yīng)，通過STAT-6 通路促肺成纖維細(xì)胞分化［9］;也能增強(qiáng)IL-5 促Eos 分化、向氣道浸潤(rùn)，誘導(dǎo)Eos、T 細(xì)胞等在氣道聚集。作為Eos 最重要的活化因子之一的IL-5，對(duì)Eos 在呼吸道的活化、聚集、浸潤(rùn)，抑制Eos 凋亡，導(dǎo)致Eos 增多和呼吸道炎性反應(yīng)持續(xù)存在等方面，均起了重要的正向調(diào)控作用;協(xié)同IL-4 促進(jìn)IgE 合成;增強(qiáng)血小板激活因子(PAF)和白三烯B4(LTB4)對(duì)Eos 的趨化作用。因此血清IgE、IL-4 及IL-5 水平檢測(cè)是反映哮喘炎性反應(yīng)程度的敏感、快速的指標(biāo)。

與Ⅰ組相比較，Ⅱ組及Ⅳ組小鼠血清TIgE、IL-4及IL-5 表達(dá)均升高，差異有顯著性(P＜0.05)，符合過敏性哮喘發(fā)病的特點(diǎn)，也符合旋毛蟲感染的特點(diǎn)。Ⅲ組小鼠與Ⅱ組小鼠相比較，TIgE、IL-4 及IL-5 表達(dá)均降低，差異有顯著性(P＜0.05)，Ⅳ組與Ⅱ組小鼠相比較，TIgE、IL-4 及IL-5 表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)，提示雖然小鼠感染旋毛蟲與誘發(fā)過敏性哮喘同樣存在IgE 水平升高，Th2 反應(yīng)亢進(jìn)的現(xiàn)象，但旋毛蟲感染對(duì)誘發(fā)哮喘時(shí)TIgE、IL-4 及IL-5 的表達(dá)有抑制作用，此結(jié)果與寄生蟲感染對(duì)過敏有一定的緩解和抑制作用的觀點(diǎn)相符［10，11］。

旋毛蟲感染或其他蠕蟲感染，可誘導(dǎo)宿主的Th2 型免疫應(yīng)答，與過敏性哮喘同樣存在Th2 反應(yīng)偏移的現(xiàn)象，但卻對(duì)哮喘有抑制作用，分析其中的影響機(jī)制之一可能與旋毛蟲感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗旋毛蟲特異性IgE 對(duì)變應(yīng)原特異性IgE 有抑制作用等有關(guān)。其次，小鼠感染旋毛蟲的免疫反應(yīng)中還啟動(dòng)了多種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，可能與緩解過敏反應(yīng)有關(guān)，IgE水平的下調(diào)也可能與其產(chǎn)生的細(xì)胞因子及其他相關(guān)細(xì)胞因子有關(guān);此外旋毛蟲的可溶性抗原物質(zhì)及宿主產(chǎn)生的刺激分泌物對(duì)免疫系統(tǒng)都可產(chǎn)生相應(yīng)的作用。雖然目前多數(shù)研究支持感染寄生蟲對(duì)過敏反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展有一定的抑制作用，但具體的影響機(jī)制尚未有定論，其具體作用途徑、免疫機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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