国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

小鼠鐵過(guò)載模型的建立及其對(duì)骨髓造血功能的影響

2013-11-08 07:02趙明峰李德冠孟娟霞盧文藝孟愛(ài)民
關(guān)鍵詞:光鏡鐵劑脾臟

柴 笑,趙明峰,李德冠,孟娟霞,盧文藝,穆 娟,孟愛(ài)民

1天津醫(yī)科大學(xué) 一中心臨床學(xué)院 天津市第一中心醫(yī)院血液科,天津300192

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300192

鐵過(guò)載是鐵代謝紊亂的疾病。臨床上分特發(fā)性和繼發(fā)性,特發(fā)性是先天性代謝障礙導(dǎo)致體內(nèi)鐵過(guò)度蓄積,為常染色體隱性遺傳;繼發(fā)性血色病常因大量輸血、長(zhǎng)期內(nèi)服鐵劑、慢性酒癖并攝入含鐵飲食或某些血液病等導(dǎo)致。鐵過(guò)載可引起廣泛纖維化及臟器功能損害,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量甚至死亡。無(wú)論是遺傳性的地中海貧血還是獲得性的骨髓增生異常綜合征,輸血依賴的患者都有更高的發(fā)病率和死亡率,且與鐵過(guò)載的程度非常相關(guān),因此鐵過(guò)載越來(lái)越成為臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。但是由于臨床患者個(gè)體差異性較大,取材所限,可重復(fù)性差,很難深入研究鐵過(guò)載對(duì)骨髓造血功能的作用及機(jī)制。本研究探索性地使用動(dòng)物模型去模擬臨床情況,首先建立小鼠鐵過(guò)載模型,然后檢測(cè)其骨髓造血功能的變化,為深入研究鐵過(guò)載對(duì)骨髓造血功能的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

材料 動(dòng)物:C57BL/6純系小鼠40只,雄性,體重20~22 g,購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,合格證號(hào):SCXK(京)2009-0017,小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。試劑及儀器:右旋糖酐鐵注射液購(gòu)自丹麥Pharmacosmos廠家,RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物公司,甲基纖維素培養(yǎng)基MethoCult?GF M3434購(gòu)自StemCell公司,鈣熒光素乙酰氧基甲酯 (Calcein-AM)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,16#平頭注射器針頭,日本Olympus倒置顯微鏡,美國(guó)Beckman Coulter Altra流式細(xì)胞儀,日本Sysmex poch100i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀。

分組及處理 使用隨機(jī)區(qū)組法將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組10只,每次腹腔注射生理鹽水0.2 ml;低劑量鐵劑組10只,每次腹腔注射質(zhì)量濃度為12.5 mg/ml的右旋糖酐鐵0.2 ml;中劑量鐵劑組10只,每次腹腔注射質(zhì)量濃度為25 mg/ml的右旋糖酐鐵0.2 ml;高劑量鐵劑組10只,每次腹腔注射質(zhì)量濃度為50 mg/ml的右旋糖酐鐵0.2 ml。每3天注藥1次,在給藥6周后處死小鼠。

血細(xì)胞計(jì)數(shù) 摘除眼球取血并用K3EDTA抗凝,用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)每組10只小鼠的白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白和紅細(xì)胞。

病理組織學(xué)檢查 頸部脫臼處死小鼠,取各組小鼠肝臟、脾臟及胸骨。(1)肉眼觀察; (2)光鏡觀察:常規(guī)切片,蘇木精-伊紅染色,400倍鏡下觀察其病理形態(tài)學(xué)改變;普魯士藍(lán)鐵染色,油鏡下觀察骨髓鐵的分布情況。

骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)分離及計(jì)數(shù) 無(wú)菌剪刀和鑷子分離出雙側(cè)股骨和脛骨,利用滅菌過(guò)的剝骨紙和鑷子把小鼠骨頭上肌肉剔除干凈,用剪刀剪除骨頭兩端少許,將每只小鼠的單側(cè)股骨放至含1 ml Hank’s液的Ep管中,沖洗骨髓腔,收集單細(xì)胞懸液,用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)BMMNCs。收集每組小鼠的股骨和脛骨,放入冰上含有7~8 ml Hank’s液的無(wú)菌玻璃平皿中,用無(wú)菌注射器把骨髓沖入無(wú)菌玻璃平皿中,并用注射器反復(fù)吹打細(xì)胞溶液3次,把骨髓吹打成單細(xì)胞懸液。按淋巴細(xì)胞分離液∶細(xì)胞懸液 =1∶2進(jìn)行分離,得到的BMMNCs用Hank’s液離心洗滌2次,最后棄去上清,先加入1~2 ml完全培養(yǎng)基 (含20%胎牛血清,1%青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基)徹底蕩起沉淀,然后加到合適體積后計(jì)數(shù),稀釋到所需濃度用于以下實(shí)驗(yàn)。

BMMNCs內(nèi)不穩(wěn)定鐵(labile iron pool,LIP)的檢測(cè) Calcein-AM是一種膜滲透性螯合劑,它能進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)被酯酶分解,釋放出Calcein發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。如果細(xì)胞存在LIP,LIP能與Calcein可逆性結(jié)合,進(jìn)而淬滅其熒光。本研究用Calcein-AM標(biāo)記不同處理組細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)Calcein的平均熒光強(qiáng)度 (mean fluorescent intensity,MFI)反映細(xì)胞內(nèi) LIP水平[2]。將各組 BMMNCs濃度調(diào)整為 1×106/ml,取 100 μl即1×105個(gè)細(xì)胞,加20 μl Calcein-AM,37℃避光孵育10 min,用預(yù)冷的PBS離心洗滌2次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組BMMNCs的MFI。

BMMNCs集落培養(yǎng) 收集各組BMMNCs,并將濃度調(diào)整為2×105/ml,加200 μl細(xì)胞至2 ml M3434,振蕩器充分混勻,4℃靜置30 min,待氣泡消失,用注射器連接16#平頭注射器針頭,吸取500 μl細(xì)胞混懸液,加入24孔板,輕搖培養(yǎng)板,使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7~12 d,于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,低倍觀察集落形成情況,細(xì)胞數(shù)≥30為陽(yáng)性集落,高倍鏡下對(duì)粒-單系集落形成單位數(shù)、紅系集落形成單位數(shù)、混合系集落形成單位數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以±s表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

鐵過(guò)載小鼠的一般表現(xiàn)

膚色:與對(duì)照組相比,低、中、高劑量鐵劑組小鼠在注藥第2周時(shí),耳、腳爪、尾巴出現(xiàn)漸深的鐵銹色,牙齒呈黃褐色改變,且皮毛開(kāi)始變得稀疏、粗糙、無(wú)光澤,并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加,上述表現(xiàn)更加明顯。

行為改變:隨著注藥時(shí)間的延長(zhǎng)及累積劑量的增加,低、中、高劑量鐵劑組小鼠活動(dòng)減少,反應(yīng)遲鈍,易受驚嚇,出現(xiàn)精神紊亂癥狀,且高劑量鐵劑組小鼠死亡4只。

體重改變:最初各組小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著體內(nèi)累積劑量的增加,低、中、高劑量鐵劑組小鼠飲食明顯減少,生長(zhǎng)緩慢,體重不增或下降,在第6周4組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)(圖1)。

小鼠鐵過(guò)載模型的建立

肝臟HE染色:對(duì)照組小鼠肝臟未見(jiàn)明顯的病理改變,光鏡下細(xì)胞排列整齊、形態(tài)規(guī)則 (圖2A);低劑量鐵劑組小鼠肝臟肉眼未見(jiàn)明顯改變,光鏡下肝細(xì)胞排列雜亂,可見(jiàn)部分細(xì)胞胞漿出現(xiàn)褐色鐵沉積 (圖2B);中劑量鐵劑組小鼠肝臟肉眼可見(jiàn)輕度增大,水腫、淤血,光鏡下肝細(xì)胞可見(jiàn)團(tuán)塊狀褐色鐵沉積 (圖2C);高劑量鐵劑組小鼠肝臟肉眼可見(jiàn)明顯淤血,整個(gè)肝臟呈深褐色,光鏡下肝細(xì)胞凝固性壞死,核固縮、溶解,胞漿內(nèi)滿布鐵顆粒 (圖2D)。

圖1 各組小鼠體重變化曲線圖Fig 1 Results of different groups mice weight change over days

脾臟HE染色:對(duì)照組小鼠脾臟未見(jiàn)明顯的病理改變,光鏡下細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,可見(jiàn)脾小體 (圖3A);低劑量鐵劑組小鼠脾臟出現(xiàn)輕度淤血,光鏡下脾細(xì)胞排列雜亂,脾臟邊緣區(qū)及紅髄區(qū)出現(xiàn)褐色鐵沉積,呈放射狀分布,脾小體未受累 (圖3B);中劑量鐵劑組小鼠脾臟肉眼可見(jiàn)淤血水腫,光鏡下脾臟邊緣區(qū)及紅髄區(qū)可見(jiàn)團(tuán)塊狀褐色鐵沉積 (圖3C);高劑量鐵劑組小鼠脾臟肉眼可見(jiàn)明顯淤血,整個(gè)脾臟呈深褐色,光鏡下脾臟滿布鐵顆粒,脾小體與紅髄區(qū)界限不清 (圖3D)。

骨髓活檢HE染色及普魯士藍(lán)鐵染色:對(duì)照組小鼠骨髓光鏡下細(xì)胞排列整齊,形態(tài)規(guī)則;普魯士藍(lán)鐵染色未見(jiàn)被染成藍(lán)色的鐵 (圖4A1、4A2)。低劑量鐵劑組骨髓光鏡下未見(jiàn)明顯鐵顆粒;鐵染色細(xì)胞內(nèi)外均可見(jiàn)少量被染成藍(lán)色的鐵顆粒 (圖4B1、4B2)。中劑量鐵劑組骨髓可見(jiàn)細(xì)胞外有若干棕色鐵顆?;驁F(tuán)塊,呈梭形或不規(guī)則狀;鐵染色細(xì)胞內(nèi)外均可見(jiàn)被染成藍(lán)色的鐵顆?;驁F(tuán)塊 (圖4C1、4C2)。高劑量鐵劑組骨髓細(xì)胞外有大量鐵存在,呈塊狀;鐵染色可見(jiàn)視野滿布藍(lán)色鐵團(tuán)塊 (圖4D1、4D2)。

BMMNCs內(nèi)LIP由于細(xì)胞內(nèi)存在的LIP可以淬滅熒光探針Calcein,因此根據(jù)Calcein的MFI強(qiáng)弱測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)LIP的相對(duì)水平。對(duì)照組MFI 41.44±5.53,低劑量鐵劑組MFI 39.8±5.94,中劑量鐵劑組MFI 38.42±6.76,高劑量鐵劑組38.33±6.15,4組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

骨髓造血細(xì)胞集落形成能力的變化 低、中、高劑量鐵劑組小鼠骨髓細(xì)胞粒-單系集落形成單位數(shù)和對(duì)照組相比均顯著下降 (P<0.05),中、高劑量鐵劑組小鼠骨髓細(xì)胞紅系集落形成單位數(shù)、混合系集落形成單位數(shù)和對(duì)照組相比顯著下降 (P<0.05)(圖5)。

BMMNCs計(jì)數(shù) 對(duì)照組BMMNCs計(jì)數(shù) (30.87±3.61)×106/Femur,低劑量鐵劑組 (28.41±3.80)×106/Femur,中劑量鐵劑組 (27.64±1.65)×106/Femur,高劑量鐵劑組 (30.95±4.72)×106/Femur,4組骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

外周血象的變化 和對(duì)照組相比,低、中、高劑量鐵劑組外周血白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、血紅蛋白差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,血小板低、中、高劑量鐵劑組和對(duì)照組相比有輕度下降趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

圖2 肝臟HE染色結(jié)果 (×400)Fig 2 HE staining of livers(×400)

圖3 脾臟HE染色結(jié)果 (×400)Fig 3 HE staining of spleens(×400)

圖4 骨髓HE染色 (A1~D1)(×400)及普魯士藍(lán)鐵染色 (A2~D2)(×1000)Fig 4 HE staining(A1-D1)(×400)and Prussian blue iron staining(A2-D2)(×1000)of bone marrow

圖5 各組小鼠造血集落形成單位數(shù)Fig 5 Hematopoietic colony-forming units of different groups

討 論

鐵過(guò)載 (血色病)是鐵代謝紊亂的疾病。鐵在體內(nèi)過(guò)度沉積,不但可導(dǎo)致重要臟器 (尤其是肝臟、脾臟、心臟和胰腺等)的結(jié)構(gòu)損害和功能障礙,對(duì)骨髓造血及血液系統(tǒng)疾病的影響也不容樂(lè)觀。近年的一些臨床證據(jù)顯示鐵過(guò)載可抑制骨髓的造血功能[3-5]。由于臨床患者取材受限,可重復(fù)性差,個(gè)體差異性也較大,鐵過(guò)載機(jī)制研究進(jìn)展緩慢,目前關(guān)于此方面的報(bào)道甚少。因此,建立小鼠鐵過(guò)載模型對(duì)深入研究鐵過(guò)載對(duì)骨髓造血功能的作用及機(jī)制有著重要的意義。

本研究通過(guò)給小鼠定期定量腹腔注射右旋糖酐鐵,成功建立了小鼠鐵過(guò)載模型。鐵過(guò)載模型小鼠肝臟、脾臟中可見(jiàn)大量鐵沉積,這與臨床鐵過(guò)載患者肝臟、脾臟鐵大量沉積是一致的,與朱航等[6]的研究結(jié)果類似,但是朱航等[6]側(cè)重于研究過(guò)量的鐵在體內(nèi)貯存對(duì)機(jī)體各臟器的損傷,對(duì)骨髓功能的影響未涉及。本研究創(chuàng)新性地對(duì)骨髓造血功能進(jìn)行初步探索。骨髓活檢的結(jié)果顯示有大量鐵存在于骨髓基質(zhì),BMMNCs內(nèi)LIP結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,更進(jìn)一步表明骨髓鐵過(guò)載存在,但是鐵主要存在于骨髓基質(zhì)而非細(xì)胞內(nèi),與筆者前期體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在一定差異[7-8]。臨床鐵過(guò)載情況一般發(fā)生于骨髓損傷的患者如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等輸血所致,這些患者的骨髓狀況本身是不好的,在此基礎(chǔ)上給予輸血容易導(dǎo)致鐵過(guò)載的發(fā)生。而本研究用的正常小鼠建立鐵過(guò)載模型,可能機(jī)體由于強(qiáng)大的代償機(jī)制未發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞鐵沉積,這是本研究鐵過(guò)載小鼠模型的不足之處。在病態(tài)骨髓的基礎(chǔ)上建立鐵過(guò)載模型,可能獲得與臨床繼發(fā)性鐵過(guò)載一致的結(jié)果。

表1 各組小鼠外周血象的改變 (n=10,±s)Table 1 Counts of peripheral blood cells(n=10,±s)

表1 各組小鼠外周血象的改變 (n=10,±s)Table 1 Counts of peripheral blood cells(n=10,±s)

組別Group 白細(xì)胞White blood cells(×109/L)血小板Platelets(×109/L)紅細(xì)胞Red blood cells(×109/L)血紅蛋白Hemoglobin(g/L)對(duì)照組Control group 8.43±0.24 926.0±28.23 8.94±0.08 135.3±1.21低劑量鐵劑組Low-dose iron group 8.73±0.83 780.7±39.60 8.86±0.21 146.8±6.01中劑量鐵劑組Middle-dose iron group 8.62±1.21 676.2±21.43 8.78±0.71 132.4±1.23高劑量鐵劑組High-dose iron group 8.27±0.89 587.3±19.67 8.65±0.97 131.9±4.62

在初步建立鐵過(guò)載小鼠模型的基礎(chǔ)上,本研究首先觀察了鐵過(guò)載對(duì)BMMNCs數(shù)目及功能的影響,發(fā)現(xiàn)集落形成單位數(shù)顯著下降,計(jì)數(shù)各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明鐵過(guò)載確實(shí)損傷了骨髓造血功能,進(jìn)一步觀察外周血象的改變,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,各劑量鐵劑組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,僅血小板有下降趨勢(shì),考慮可能由于正常骨髓造血功能儲(chǔ)備比較強(qiáng)大,鐵過(guò)載對(duì)正常骨髓功能的損傷不足以引起外周血象的顯著改變。這與臨床原發(fā)性鐵過(guò)載患者的臨床表現(xiàn)類似,而與繼發(fā)性鐵過(guò)載患者的臨床表現(xiàn)存在一定差異。

綜上,本研究通過(guò)給小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵成功建立鐵過(guò)載模型,但是由于正常骨髓強(qiáng)大的代償功能,雖然鐵過(guò)載對(duì)骨髓造血集落有較明顯的影響,而該影響不足以引起外周血象的改變。這現(xiàn)象與臨床上原發(fā)性鐵過(guò)載患者的情況基本符合,為以后深入研究鐵過(guò)載發(fā)病的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?/p>

[1]Zhang B,Donga PZ,Corral M,et al.Pharmacoeconomic considerations in treating iron overload in patients with β-thalassaemia,sickle cell diseaseand myelodysplastic syndromes in the US:a literature review [J].Pharmacoeconomics,2011,29(6):461-474.

[2]Prus E,F(xiàn)ibach E.Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells[J].Cytometry A,2008,73(1):22-27.

[3]Hartmann J,Braulke F,Sinzig U,et al.Iron overload impairs proliferation of erythroid progenitors cells(BFU-E)from patients with myelodysplastic syndromes [J].Leuk Res,2013,37(3):327-332.

[4]Taoka K,Kumano K,Nakamura F,et al.The effect of iron overload and chelation on erythroid differentiation [J].Int J Hematol,2012,95(2):149-159.

[5]Oliva EN,Ronco F,Marino A,et al.Iron chelation therapy associated with improvement of hematopoiesis in transfusion-dependent patients[J].Transfusion,2010,50(7):1568-1570.

[6]朱航,羅海吉,鄧紅,等.高鐵小鼠模型的構(gòu)建及鐵代謝相關(guān)指標(biāo)的觀察[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(8):1593-1597.

[7]謝芳,趙明峰,李玉明,等.鐵過(guò)載誘導(dǎo)活性氧生成對(duì)骨髓造血功能影響的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中華血液學(xué)雜志,2011,32(9):606-609.

[8]盧文藝,趙明峰,Sajin Rajbhandary,等.鐵過(guò)載催化的氧化應(yīng)激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2013,35(1):6-12.

猜你喜歡
光鏡鐵劑脾臟
孩子貧血能食補(bǔ)嗎
漢皎光鏡銘文釋考
2 使用減光鏡進(jìn)行慢速快門拍攝
術(shù)后靜脈補(bǔ)充鐵劑并不能改善分期雙側(cè)膝關(guān)節(jié)置換血紅蛋白水平和輸血率
脾臟也會(huì)出現(xiàn)鈣化
摘除脾臟后,請(qǐng)注意這些變化
鐵劑
——忌食
口服鐵劑有禁忌嗎?
腹腔鏡脾切除術(shù)治療脾臟腫瘤的護(hù)理體會(huì)
慢性鼻竇炎鼻息肉內(nèi)鏡鼻竇術(shù)后上頜竇口黏膜恢復(fù)過(guò)程分析