侯紅平，張立海，張里程，藍(lán) 霞，劉道宏，熊 琦，唐佩福

1中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院骨科，北京100853

2南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津300071

在組織胚胎發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)元胞體與其靶細(xì)胞或靶器官在相對(duì)較短的距離內(nèi)建立軸突聯(lián)系后，生長(zhǎng)錐、化學(xué)因子趨化作用和物理引導(dǎo)作用隨即消失［1-2］。隨著動(dòng)物軀體的增長(zhǎng)，胞體與其靶細(xì)胞或器官之間的軸突聯(lián)系也隨之增長(zhǎng)，而此時(shí)軸突延長(zhǎng)的唯一可能解釋就是機(jī)械牽引力的牽拉［3-5］。機(jī)械力牽拉引起的軸突增長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)軸突內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸或軸突出芽再生的速度。以藍(lán)鯨為例，其生長(zhǎng)速度可以達(dá)到每天3 cm左右，軸突的牽拉延長(zhǎng)也需與身體的生長(zhǎng)速度相一致，而慢速軸漿運(yùn)輸每天卻只能達(dá)到幾毫米［6-7］。在臨床病例，尤其是骨科患者中，存在眾多神經(jīng)軸突牽拉損傷的案列，包括地震、車禍、撞擊等固定姿勢(shì)過(guò)度牽拉某一部位的神經(jīng)造成的牽拉傷，重則損傷神經(jīng)無(wú)法行使正常功能，輕則神經(jīng)及其支配的肌肉經(jīng)常性的神經(jīng)痛，對(duì)患者造成不同程度的心理和身體的傷害，因此對(duì)軸突牽拉后的生物學(xué)變化及其相關(guān)機(jī)制的研究已成為解決臨床牽拉傷的迫切需要。在相關(guān)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，軸突牽拉模型有很多種，主要包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物生物膜牽拉軸突、球囊吸附牽拉、體外神經(jīng)牽延器、固定體位神經(jīng)牽拉等。本文主要從形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、細(xì)胞代謝和動(dòng)作電位等方面對(duì)近幾年有關(guān)軸突牽拉的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

軸突牽拉后的形態(tài)學(xué)變化

機(jī)械力牽拉后，軸突為適應(yīng)這一變化，在方向、直徑和表面形態(tài)等方面也存在相應(yīng)的變化。

首先，軸突的方向。體外培養(yǎng)的神經(jīng)元建立的軸突聯(lián)系的方向是雜亂無(wú)章的，但有研究顯示軸突牽拉后，原本隨機(jī)分布的軸突與周圍的小束發(fā)生連接，逐漸聯(lián)合成較大的束，其方向逐漸取得一致［8］。這也提示機(jī)械力在軸突方向的可塑性上發(fā)揮重要的作用。這一發(fā)現(xiàn)也被科研學(xué)者應(yīng)用到了神經(jīng)損傷修復(fù)的移植方面［9］。眾所周知，神經(jīng)損傷后移植神經(jīng)的來(lái)源存在較大的爭(zhēng)議，但培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)牽拉后，其生長(zhǎng)長(zhǎng)度和方向?yàn)橐浦采窠?jīng)提供了可靠的通道和來(lái)源。因此經(jīng)牽拉后的神經(jīng)將成為修復(fù)神經(jīng)的重要來(lái)源。

其次，軸突的直徑。軸突在機(jī)械力作用后，其粗細(xì)必然會(huì)發(fā)生改變。Pfister等［2］研究顯示，軸突的平均直徑在牽拉后非但沒(méi)有變細(xì)，反而增粗了約30%。另有研究顯示，軸突的直徑在牽拉后先變細(xì)后增粗［10-11］。筆者認(rèn)為，之所以出現(xiàn)這種差異，在于不同的課題組采用的牽拉體系有所不同，另外軸突牽拉后觀察時(shí)間點(diǎn)的不同對(duì)觀察結(jié)果也有較大影響。因此，軸突牽拉后的直徑變化需要更統(tǒng)一的模型，更確切、更實(shí)時(shí)的觀察手段去驗(yàn)證。但是，不管軸突的直徑如何變化，其中的生化機(jī)制和相關(guān)蛋白的合成卻是值得考慮的，軸突牽拉后如何能夠在短時(shí)間內(nèi)合成所需的蛋白來(lái)滿足需要，這也將是今后研究的重中之重。

最后，表面形態(tài)方面。Smith等［12］和 Kilinc等［13］在軸突牽拉后發(fā)現(xiàn)了一種稱為“延遲彈性”的現(xiàn)象，原本彎曲呈波浪狀的軸突在牽拉過(guò)程中方向筆直，而牽拉完成后又會(huì)恢復(fù)為原始狀態(tài)，他將此現(xiàn)象歸咎于軸突形狀的分子記憶，但尚缺少明確的證據(jù)［2，6，8］。這是否是軸突的一種自我修復(fù)或保護(hù)機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步的研究。另外，有學(xué)者在不同的牽拉體系均發(fā)現(xiàn)軸突牽拉后其表面出現(xiàn)了不同大小的“隆起物”，經(jīng)過(guò)激光共聚焦染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架神經(jīng)絲在此聚集［13］。細(xì)胞骨架聚集于此的機(jī)制到目前尚未得到闡明，需做進(jìn)一步的研究與探討。筆者分析可能與物質(zhì)運(yùn)輸速率的增快密切相關(guān)。

軸突牽拉后形態(tài)上發(fā)生的變化，對(duì)其深入研究的探討將會(huì)進(jìn)一步揭示軸突生理性牽拉和病理性牽拉的區(qū)別，從而更好地運(yùn)用牽拉后的神經(jīng)，解決病理性牽拉所引起的功能障礙。

軸突牽拉后的細(xì)胞膜變化

細(xì)胞膜不僅為細(xì)胞的正常生命活動(dòng)提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，其完整性和功能的正常性對(duì)物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞和各種酶的活性有重要的意義。因此，軸突牽拉后對(duì)其細(xì)胞膜的研究顯得尤為重要。目前研究主要集中在對(duì)細(xì)胞膜完整性和通透性的研究。普遍認(rèn)為，軸突牽拉后，細(xì)胞膜出現(xiàn)不同程度的損傷，與牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間密切相關(guān)。

細(xì)胞膜通透性的變化 辣根過(guò)氧化物酶是檢測(cè)細(xì)胞膜通透性的常用物質(zhì)，原本不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的辣根過(guò)氧化物酶在牽拉后出現(xiàn)不同程度的可通透性，牽拉強(qiáng)度越大，其通透的能力越強(qiáng)，生物膜的損傷程度越大［14-16］。有學(xué)者分析指出，細(xì)胞膜上出現(xiàn)了一定大小的孔，從而使不能進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)通過(guò)孔道進(jìn)入細(xì)胞［13，17］。在以熒光分子作為染料標(biāo)記細(xì)胞的研究中，細(xì)胞膜呈現(xiàn)不通透、通透、通透性減弱的發(fā)展趨勢(shì)［18-19］，表明細(xì)胞膜在牽拉后出現(xiàn)一定的損傷，但同時(shí)細(xì)胞膜具有一定的自我修復(fù)能力。這可能與細(xì)胞膜通透性改變、Ca2+透過(guò)細(xì)胞膜、啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一定的信號(hào)通路或修復(fù)機(jī)制引起細(xì)胞膜的自我修復(fù)相關(guān)。但其中具體的修復(fù)途徑仍需進(jìn)一步的研究。

利用不同相對(duì)分子質(zhì)量和直徑的熒光分子，可以判定出細(xì)胞膜牽拉后出現(xiàn)的孔的大小，但這也只是粗略的估計(jì)，是否出現(xiàn)孔，孔的直徑有多大尚需要結(jié)合一定的研究手段做出分析。另外，表面活性劑能夠限制細(xì)胞內(nèi)分子的不可控制的釋放，可作為修復(fù)細(xì)胞膜通透性的研究物質(zhì)，從而保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷和代謝失衡的影響。通過(guò)對(duì)牽拉細(xì)胞軸突的生物膜的通透性的研究，有望將來(lái)發(fā)展成為新型的過(guò)濾生物膜，可應(yīng)用在污染水的生物過(guò)濾等方面。利用不同孔徑的生物膜可實(shí)現(xiàn)生物的精細(xì)分類。

細(xì)胞膜上離子通道的變化 細(xì)胞膜上存在一定的離子通道，如K+、Na+、Ca2+通道，細(xì)胞膜通透性的改變對(duì)其上的離子通道的通透性有一定的影響。有研究表明，軸突牽拉后，K+、Na+的敏感性和活性均未發(fā)生改變，但其密度卻出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象［20］。在胞體中，K+、Na+通道的密度均出現(xiàn)了增高的趨勢(shì);而在軸突中，Na+的密度增加，而K+的密度卻未發(fā)生變化［8，21］。對(duì)這種差異性的出現(xiàn)目前尚未做出合理的解釋。另外，軸突牽拉后發(fā)現(xiàn)了Na+和Ca2+的內(nèi)流［22］。Na+內(nèi)流的可能機(jī)制有以下3種:(1)Na+通道的通透性增強(qiáng)引起Na+的內(nèi)流;(2)Na+-K+酶的活性降低引起Na+的內(nèi)流，這可能與線粒體的損傷有關(guān);(3)Na+泵的損傷造成Na+的內(nèi)流，與能量供應(yīng)不足相關(guān)。Serbest等［23］提出 Ca2+內(nèi)流的3種相關(guān)機(jī)制:(1)軸突牽拉后，引起Na+通道的開(kāi)放，Ca2+通過(guò)Na+通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起Ca2+的內(nèi)流;(2)軸突牽拉后，不正常Na+的內(nèi)流引起Na+-Ca2+交換體的逆轉(zhuǎn)。Na+-Ca2+交換體是利用Na+的內(nèi)流引起Ca2+排出細(xì)胞外，但逆轉(zhuǎn)后卻引起Ca2+的內(nèi)流;(3)軸突牽拉Na+內(nèi)流引起細(xì)胞去極化，從而激活Ca2+依賴的電壓門控通道引起Ca2+的內(nèi)流。但究竟是哪種機(jī)制引起Na+和Ca2+的內(nèi)流，或者幾種機(jī)制相互作用，仍需做進(jìn)一步的驗(yàn)證和解釋。軸突牽拉后生物膜的變化，尚有許多問(wèn)題有待解決，例如軸突是否存在傳導(dǎo)機(jī)械力的通道和分子，這些外界的力量是如何傳到軸突的雙層磷脂膜上的，損傷的細(xì)胞中軸突在什么樣的微環(huán)境中可以得到自我修復(fù)的能力等。在今后的研究中，將著重探討軸突生物膜的通透性變化的最大程度，以及軸突自我保護(hù)和修復(fù)機(jī)制。

軸突牽拉后的細(xì)胞骨架變化

在真核細(xì)胞中，細(xì)胞骨架是保持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的纖維網(wǎng)絡(luò)，包括微絲、微管和中間絲。在神經(jīng)元中，微絲由肌動(dòng)蛋白組成，微管由微管蛋白組成，中間絲由神經(jīng)絲組成。軸突牽拉后，細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的改變。

肌動(dòng)蛋白 肌動(dòng)蛋白是微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，以兩種形式存在，即單體和多聚體。單體肌動(dòng)蛋白是由一條多肽鏈構(gòu)成的球形分子，又稱球狀肌動(dòng)蛋白;肌動(dòng)蛋白多聚體形成肌動(dòng)蛋白絲，稱為纖維狀肌動(dòng)蛋白。有關(guān)軸突生長(zhǎng)錐的研究中，肌動(dòng)蛋白處于生長(zhǎng)錐的前端，通過(guò)其前端的解聚和后端的再聚合對(duì)生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)提供一定的方向［24］。但在生長(zhǎng)錐消失后以及建立突觸聯(lián)系的軸突在牽拉后的肌動(dòng)蛋白的相關(guān)情況鮮有報(bào)道。

微管蛋白 微管蛋白是球形分子，有兩種類型:α微管蛋白和β微管蛋白，這兩種微管蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密地結(jié)合成二聚體，作為微管組裝的亞基。Tang-Schomer等［9］研究顯示，在軸突牽拉完成后，用Taxol處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在180 min后逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)，而在40 min后若將Taxol洗去，細(xì)胞的恢復(fù)時(shí)間和恢復(fù)程度遠(yuǎn)低于用Taxol處理的細(xì)胞，若用Nocodazole處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在40 min后發(fā)生斷裂，提示神經(jīng)軸突在牽拉完成后，存在一定的損傷，這種損傷可以通過(guò)自身修復(fù)，而微管蛋白在這種修復(fù)的過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。另外，微管蛋白作為細(xì)胞快速軸漿運(yùn)輸?shù)臉?gòu)成成分，在軸突牽拉后的密度有所下降［13］，可能與鈣離子內(nèi)流聚集濃度升高引起微管蛋白的解聚有關(guān)。

神經(jīng)絲 神經(jīng)絲是存在于神經(jīng)細(xì)胞軸突中的一種特化的中間絲，除有支持作用外，還與物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)。Chung等［25］應(yīng)用激光共聚焦定位發(fā)現(xiàn)，軸突牽拉后神經(jīng)絲集中在軸突的“隆起物”中，提示神經(jīng)絲在此聚集，作為內(nèi)源性因子可能觸發(fā)軸突運(yùn)輸?shù)钠茐膹亩疠S突直徑的增粗。另外，Hoffman等［26］還發(fā)現(xiàn)軸突牽拉后，出現(xiàn)了神經(jīng)絲環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且隨著牽拉強(qiáng)度的增大有增多的趨勢(shì)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能與軸突的自我保護(hù)有關(guān)。另有研究顯示，神經(jīng)絲與神經(jīng)絲之間的距離下降［25］。神經(jīng)絲除了主干外，在主干周圍還存在類似于側(cè)臂的結(jié)構(gòu)，這種側(cè)臂有3種亞型，神經(jīng)絲-重鏈、神經(jīng)絲-輕鏈、神經(jīng)絲-中間鏈。而側(cè)臂之間主要由蛋白質(zhì)的-COOH組成，-COOH通常被磷酸化，從而通過(guò)負(fù)電荷的相互排斥引起側(cè)臂向各個(gè)方向的延伸，引起神經(jīng)絲構(gòu)成支持軸突的骨架。有報(bào)道，軸突牽拉后，這種神經(jīng)絲間的距離下降從而引起神經(jīng)絲的聚集［14］。筆者分析可能由于軸突牽拉引起鈣離子的內(nèi)流，激活鈣激活中性蛋白酶，從而抑制神經(jīng)絲側(cè)臂-COOH的去磷酸，失去負(fù)電荷之間的排斥力，從而降低神經(jīng)絲之間的距離，引起神經(jīng)絲的聚集。

機(jī)械力作用后，神經(jīng)元與軸突的細(xì)胞骨架均出現(xiàn)了不同程度的變化，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化、密度的增加或減少以及之間的相互作用，均引起胞漿的物質(zhì)運(yùn)輸、軸突的形態(tài)功能的變化。細(xì)胞骨架在牽拉后改變的機(jī)制和修復(fù)，將成為今后研究的重點(diǎn)。

軸突牽拉后的細(xì)胞代謝

泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)Staal等［27］研究顯示軸突牽拉后，UPS和神經(jīng)絲所在的位置發(fā)生重疊，都出現(xiàn)在“隆起物”中，提示UPS在此聚集。利用蛋白酶體抑制劑和乳胞素分別處理細(xì)胞，而細(xì)胞的繼發(fā)性軸突變性加劇。蛋白酶體抑制劑和乳胞素能夠抑制UPS的活性，提示UPS聚集在“隆起物”中，可能引起細(xì)胞骨架的重新排列，起到保護(hù)神經(jīng)元的功能。

乳酸脫氫酶的釋放 乳酸脫氫酶的釋放可以作為細(xì)胞損傷的生化標(biāo)記物，Ellis等［28］和 Geddes等［29］在對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的牽拉研究中發(fā)現(xiàn)存在乳酸脫氫酶的釋放，并且隨著牽拉程度的增強(qiáng)，釋放量有增強(qiáng)的趨勢(shì)。提示在牽拉后星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的破壞。軸突牽拉后乳酸脫氫酶是否存在釋放的現(xiàn)象、釋放的時(shí)間以及相關(guān)強(qiáng)度如何均需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

糖原的積累 Maxwell等［30］研究顯示軸突牽拉后引起糖原的積累，推測(cè)可能由于鈣離子的內(nèi)流刺激糖原的合成，引起糖原的積累，為軸突運(yùn)輸提供一定的能量，減輕軸突運(yùn)輸破壞引起損傷的壓力。但糖原如何在短時(shí)間內(nèi)大量積累、細(xì)胞和軸突內(nèi)是否存在其他代償機(jī)制，均需進(jìn)一步的研究與探討。

軸突牽拉后的動(dòng)作電位變化

正常的動(dòng)作電位有Na+的內(nèi)流引起細(xì)胞的去極化，構(gòu)成動(dòng)作電位的上升峰，而K+的外流引起細(xì)胞的復(fù)極化，構(gòu)成動(dòng)作電位的下降峰。研究顯示在軸突牽拉后，隨著牽拉程度的不斷增大，細(xì)胞的動(dòng)作電位有3個(gè)階段不同的損傷［31-32］。(1)電位傳導(dǎo)的部分損失，但這種損失是可逆的，提示可能是由于短暫的離子流的紊亂引起的。(2)可能復(fù)合動(dòng)作電位的振幅增加，但可通過(guò)加入4-四氨基吡啶恢復(fù)，提示可能是由于髓鞘損傷引起的。(3)即使用4-四氨基吡啶處理也不可逆的動(dòng)作電位損傷，可能由于解剖學(xué)上的膜損傷引起的。

綜上，利用機(jī)械力作用于神經(jīng)元，可引起神經(jīng)元和軸突相應(yīng)的生理生化的改變，但神經(jīng)元如何通過(guò)這些改變來(lái)適應(yīng)機(jī)械力、維持自身正常功能并未得到圓滿解決，未來(lái)需要更統(tǒng)一的牽拉模型、更確切的觀察方法、更實(shí)時(shí)的技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)軸突牽拉后胞體和軸突改變的研究。通過(guò)對(duì)這一方面的基礎(chǔ)研究，明確生理性牽拉和病理性牽拉的臨界點(diǎn)。在生理性范圍內(nèi)牽拉的軸突，可作為治療周圍神經(jīng)損傷的支架，通過(guò)修復(fù)病理性牽拉的軸突，可改善損傷后功能的恢復(fù)，這將為臨床各種損傷或疾病的正確處理和治療提供一定的研究?jī)r(jià)值。

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