錢(qián)麗華，毛碧增

(1.浙江大學(xué)，浙江 杭州 310058;2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

三葉青是中國(guó)特有珍稀中藥植物，又名三葉崖爬藤、金線(xiàn)吊葫蘆、蛇附子等，含有黃酮、多糖等生物活性成分，對(duì)多種癌癥細(xì)胞株系具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且對(duì)小兒高熱、支氣管炎、病毒性腦膜炎、血液病、心腦血管疾病、抗艾滋病毒和抗腫瘤治療方面具有療效，被稱(chēng)為安全無(wú)毒的“植物青霉素”。目前因過(guò)度采挖其野生資源已瀕臨滅絕。雖三葉青組培快繁和扦插技術(shù)均已得到解決，但其塊根形成周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，因此利用組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物是解決供需矛盾的可行途徑之一。

目前對(duì)三葉青黃酮的研究集中在藥理作用上，對(duì)愈傷組織的研究集中在誘導(dǎo)分化上，對(duì)光照和溫度條件的研究還較少［1-5］。本研究旨在探索溫度、光周期等培養(yǎng)條件對(duì)三葉青愈傷生長(zhǎng)及次生代謝物形成積累的影響，為規(guī)?；a(chǎn)三葉青黃酮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

外植體試驗(yàn)材料采自建德市，取其葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并以此為試驗(yàn)材料。

培養(yǎng)基采用MS 基本培養(yǎng)基，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH)，微波萃取儀 (美國(guó)CEM 公司生產(chǎn))，UV-2550 紫外分光光度計(jì)。無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，亞硝酸鈉(天津博迪化工股份有限公司)，硝酸鋁(上海山浦化工有限公司)，NaOH (杭州化工試劑有限公司)，以上均為分析純。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 溫度試驗(yàn)

將三葉青葉片來(lái)源愈傷組織接種在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1中，每處理8 瓶，每瓶接5個(gè)。稱(chēng)取愈傷塊原始質(zhì)量W0，分別放置在23℃，25℃，28℃，30℃，34℃的光照培養(yǎng)箱中12 h·d-1培養(yǎng)30 d 后，再稱(chēng)取愈傷塊質(zhì)量W1，計(jì)算30 d 內(nèi)愈傷鮮重增長(zhǎng)率。愈傷鮮重增長(zhǎng)率/%=(W1-W0)/W0×100。

1.2.2 光周期試驗(yàn)

將三葉青葉片來(lái)源愈傷組織接種在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基中，每個(gè)處理5 瓶，每瓶接種7個(gè)愈傷塊，培養(yǎng)溫度為(27 ±1)℃，分別進(jìn)行24 h·d-1和12 h·d-1光照及暗培養(yǎng)30 d 后，測(cè)定各處理愈傷組織中總黃酮的含量。

1.3 總黃酮測(cè)定

洗去愈傷組織表面瓊脂，吸干表面水分，置于電熱干燥箱中于105℃下干燥0.5 h，使酶失活;然后60℃干燥后，用研缽磨細(xì)，繼續(xù)干燥至恒重。測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［6］(經(jīng)改良)。

對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.394 5 mg 于25 mL 容量瓶中，加適量50%乙醇超聲溶解，放冷，用50%乙醇定容至25 mL，即為對(duì)照品溶液(蘆丁濃度為0.095 78 mg·mL-1)。

供試品60%乙醇溶液。稱(chēng)取0.3 g 供試品于萃取管中，加入7.5 mL，于微波萃取儀80℃下提取25 min，提取2 次，合并提取液。其他同文獻(xiàn)［6］。

比色測(cè)定同文獻(xiàn)［6］方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。分別移取供試品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，按比色測(cè)定步驟執(zhí)行。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)葉片愈傷繼代培養(yǎng)的影響

在5個(gè)不同溫度處理下，以34℃效果最差，葉片愈傷死亡率高達(dá)100%。說(shuō)明三葉青葉片愈傷對(duì)34℃以上高溫較敏感;另外4個(gè)溫度處理中，28℃下的葉片愈傷組織鮮重增長(zhǎng)率達(dá)到394.20%，顯著優(yōu)于其余各處理;其他3個(gè)處理間無(wú)顯著差異。故28℃培養(yǎng)溫度最適于三葉青葉片愈傷的生長(zhǎng);超過(guò)34℃，則愈傷組織受到高溫傷害后無(wú)法修復(fù)而逐漸死亡(圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下愈傷鮮重增長(zhǎng)變化

2.2 不同光周期對(duì)葉片愈傷中總黃酮含量的影響

3種光周期處理后，24 h·d-1光照有利于三葉青葉片來(lái)源愈傷組織中次生代謝物黃酮類(lèi)化合物的積累。該處理下愈傷組織顏色深綠，結(jié)構(gòu)致密，但表層有褐化現(xiàn)象，總黃酮含量達(dá)20.23 mg·g-1·DW-1(表1);12 h·d-1光照下愈傷組織淺綠，結(jié)構(gòu)致密;黑暗條件下愈傷顏色為淡黃色，表層組織疏松，總黃酮含量明顯低于24 h·d-1的光照處理。因此，24 h·d-1的光照處理是三葉青愈傷組織中黃酮類(lèi)化合物積累的適宜培養(yǎng)條件。

表1 光周期對(duì)愈傷鮮重增長(zhǎng)及總黃酮含量的影響

3 小結(jié)與討論

植物組織培養(yǎng)中，光溫條件是影響生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因子，如何根據(jù)植物特性控制培養(yǎng)條件是組培中的重要問(wèn)題［7］。植物生長(zhǎng)發(fā)育具有溫度三基點(diǎn)，即最低溫度、最適溫度和最高溫度。在最適溫度下，植物細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂活躍，植物生長(zhǎng)最快。本試驗(yàn)中，28℃是三葉青愈傷生長(zhǎng)的最適溫度。

研究表明，光照在誘導(dǎo)分化時(shí)可激活某些酶的活性和光誘導(dǎo)的葉綠體代謝產(chǎn)物，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝物的積累［8］，但影響的效果因植物種類(lèi)、試驗(yàn)材料而異。光照對(duì)許多植物中黃酮類(lèi)化合物的合成有誘導(dǎo)作用［9］，葉綠體分化也與黃酮積累有關(guān)［10］，或者光照對(duì)苯丙氨酸解氨酶具有激活作用［11］。試驗(yàn)中，24 h·d-1連續(xù)光照有利于三葉青葉片來(lái)源愈傷組織中次生代謝物黃酮類(lèi)物質(zhì)的積累，而黑暗抑制黃酮化合物的合成。這與彭昕等［2］的研究結(jié)果一致。這為今后利用組培技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)三葉青黃酮提供了技術(shù)支撐。

另外，蔗糖、無(wú)機(jī)鹽、pH、前體物質(zhì)等對(duì)植物組培次生代謝物的形成和積累都存在一定的影響，后期可開(kāi)展上述因素對(duì)三葉青愈傷組織中黃酮積累的影響研究，建立起三葉青愈傷組織生產(chǎn)黃酮的可行技術(shù)工藝。

［1］盧愛(ài)芳，祁明君，李宗亮，等.三葉青愈傷組織培養(yǎng)及其總黃酮含量的研究［J］.中藥材，2010，33 (7):1042-1045.

［2］彭昕，林言娜，何軍邀，等.培養(yǎng)條件對(duì)三葉青愈傷組織生長(zhǎng)及總黃酮含量的影響［J］.藥物生物技術(shù)，2012，19(2):138-141.

［3］彭昕，張劍，何軍邀，等.三葉青松散型和致密型愈傷組織懸浮培養(yǎng)及黃酮積累的比較研究［J］.中草藥，2012，43 (3):577-580.

［4］彭昕，汪榮斌，何軍邀，等.三葉青顆粒狀愈傷組織懸浮培養(yǎng)系的建立及培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.中草藥，2012，34(5):961-965.

［5］吳浩，彭昕，林言娜，等.三葉青愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基篩選［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011 (21):121-122，125.

［6］樓肖成，郭重.三葉青總黃酮提取工藝研究［J］.海峽藥學(xué)，2011，23 (11):9-12.

［7］沈海龍.植物組織培養(yǎng)［D］.北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2005.

［8］盧文蕓，張宇斌，羅迎春，等.不同培養(yǎng)條件對(duì)環(huán)草石斛愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37 (33):16365.

［9］Fuglevand G，Jackson J.UV-B，UV-A，and blue light signal transduction pathways interact synergistically to regulate chalcone synthase gene expression in Arabidopsis ［J］.Plant Cell，1996，8:2347.

［10］崔剛，唐蕾，王武.培養(yǎng)基和外源激素對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)及葉綠素含量的影響［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，27 (2):117.

［11］王軍妮，黃艷紅，牟志美，等.植物次生代謝物黃酮類(lèi)化合物的研究進(jìn)展［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2007，33 (3):499-505.