黃 飛，李亞男，尹 飛，趙東旭，朱慶三

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemiareperfusion injury，SCII)一直是神經科學研究的難點之一，SCII 是指在某種損傷因素作用下脊髓經過一定時間缺血后得到血液再灌注后出現明顯的功能障礙，甚至出現不可逆性脊髓神經元遲發(fā)性死亡的現象［1-2］。SCII 的主要損傷因素在于再灌注后的繼發(fā)性損傷，決定了SCII 的預后。因此，保護脊髓神經元，避免脊髓水腫，是治療SCII 的關鍵所在［3-4］。目前SCII 的臨床防治方法主要包括缺血預適應，低溫、低流、低壓再灌注，藥物治療和物理治療，但是都不能從根本上改善SCII 的預后［5-7］。而且上述治療手段均以對癥治療為主，患者住院時間長，花費大，給家庭和社會帶來沉重的負擔。因此，找到一種切實有效、毒副作用小的治療方法具有重大的社會意義和經濟價值。

人參作為中國傳統中藥，具有藥性溫和、藥理作用廣泛的特點，一直廣泛應用于臨床。已有的研究發(fā)現，人參發(fā)揮作用的主要成分之一為人參皂甙，其是從人參在地表以上莖葉中提取的有效成分，目前提純的單體成分有50 多種［8-9］。近年來，我國學者嘗試將人參皂甙應用于神經系統疾病及損傷當中，取得了一定療效，但尚缺乏人參皂甙對神經系統保護作用的機制研究。在人參皂甙的多種單體中，人參皂甙單體Rb1 具有突出的抗氧化清除自由基、抗細胞凋亡和改善心肌缺血再灌注損傷等作用［10-11］。而SCII 中也涉及過量氧自由基產生和細胞凋亡等因素［12-13］，因此推測人參皂甙Rb1 可能對SCII 有一定的治療意義。因此本部分研究擬闡明人參皂甙Rb1 對SCII 的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，體重(220±20)g，吉林大學動物實驗中心提供，許可證為SCXK(吉)2008-0005。適應性飼養(yǎng)3 d。每天12 h 光照時間，自由取食飲水。

1.2 藥物

人參皂甙Rb1(純度99.9999%)為吉林大學化學實驗室提供，實驗中應用0.9%生理鹽水將人參皂甙Rb1 配置濃度為5 mg/mL 的溶液待用。

1.3 模型的建立

1.3.1 SCII 模型

將大鼠麻醉、固定，于大鼠的左側肋骨下緣中線做3 cm 左右切口，找到左側腎臟位置，進而確認腎動脈，沿腎動脈尋找腹主動脈，于腎動脈分支水平以下分離腹主動脈，用10 g 標準動脈夾持續(xù)結扎60 min，期間切口用生理鹽水紗布覆蓋。60 min 后取出動脈夾，局部撒青霉素粉2×105單位后關閉腹腔。

1.3.2 假手術組模型

過程同SCII 模型，但是不需結扎腹主動脈，同樣切口用生理鹽水紗布覆蓋持續(xù)60 min，然后局部撒青霉素粉2×105單位后關閉腹腔。

1.4 實驗分組和藥物治療方案

SD 大鼠72 只，隨機分為假手術組、實驗對照組和實驗組，每組24 只。在構建SCII 模型后記為0點，24 h 后設為1 d。分別在1 d、3 d、5 d 和7 d 這4個時間點評估大鼠神經功能及處死動物檢測相應指標。假手術組，大鼠后續(xù)不予任何處置;實驗組，SCII 模型大鼠在構建模型24 h 后給予腹腔注射10 mg/kg的人參皂甙Rb1，每天1 次，共7 d;實驗對照組，相同時間點給予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.5 評價方法

1.5.1 神經功能評分

采用Basso Beattie-Bresnahan(BBB)運動功能評分法［14］對3組模型進行后肢神經功能評分并記錄，滿分21 分，最低分0 分。

1.5.2 HE 染色

將脊髓組織固定于福爾馬林緩沖液中，無水酒精脫水后，石蠟包埋，橫斷面切成4 μm 薄片，蘇木精、伊紅染色，光鏡下觀察。

1.5.3 原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記(the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling technique，TUNEL)法染色

各組各時間點每只大鼠的連續(xù)切片中隨機抽取，做TUNEL 法染色。TUNEL 法染色過程如下:①石蠟切片，方法同HE 染色。②加入TUNEL 反應液37 ℃孵育60 min，加入Converter-POD 37℃孵育30min，DAB 顯色，樹脂封片。

光學顯微鏡鏡下觀察凋亡細胞并計數，通過計算凋亡細胞的百分比確定細胞凋亡情況。

1.6 統計學處理

所有實驗重復3 次。數據用SPSS 17.0 統計軟件處理，計量資料結果用±s 表示，組間各對應指標差異用方差分析，P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結 果

2.1 BBB 評分

假手術組大鼠雙后肢BBB 評分為21 分。實驗對照組BBB 評分顯著低于假手術組，隨著時間推移，后肢功能逐漸恢復，BBB 評分逐漸上升，但在各個時間點仍低于假手術組，說明模型成功。實驗組與實驗對照組比較可見BBB 的分值顯著增加(見圖1)。

2.2 HE 染色

病理切片HE 染色，光學顯微鏡觀察大鼠脊髓組織形態(tài)變化及細胞改變情況(見圖2)。假手術組組織結構清晰，細胞形態(tài)沒有發(fā)生改變，神經元大而多角，細胞核清晰居中，胞漿豐富。實驗對照組部分神經元受損，一些神經元胞體膨大，結構不清，可見細胞胞核固縮，組織間充血，細胞核結構不清，部分可見凋亡小體。實驗組與實驗對照組比較受損的神經元數目減少，組織充血減輕。

2.3 TUNEL 法檢測細胞凋亡

圖1 各組大鼠后肢BBB 評分情況的比較Fig.1 BBB scores of rat hindlimbs in different groups

圖2 大鼠脊髓組織HE 染色(×400)Fig.2 HE staining of rat spinal cord tissues in 3 groups(×400)

圖3 各組大鼠脊髓組織TENUL 染色細胞凋亡情況(×400)Fig.3 TUNEL staining of rat spinal cord tissues in various groups(×400)

圖4 TUNEL 染色檢測各組大鼠脊髓細胞凋亡率Fig.4 Rate of cell apoptosis in various groups measured by tunnel staining

TUNEL結果(見圖3，4)顯示凋亡細胞的細胞核固縮，顆粒深染，形態(tài)不規(guī)則。其中假手術組細胞凋亡較少，實驗對照組的細胞凋亡率較高，給予人參皂甙Rb1 干預后，細胞凋亡率與實驗對照組相比顯著降低(P＜0.05)。

3 討 論

SCII 是指在某種損傷因素作用下脊髓經過一定時間缺血后得到血液再灌注后出現明顯的功能障礙，甚至出現不可逆性脊髓神經元遲發(fā)性死亡的現象，一直是神經科學研究的難點之一。因此，保護脊髓神經元，避免脊髓水腫，是治療SCII 的關鍵所在。有研究表明在多種動物模型上夾閉胸主動脈、腹主動脈可造成相應節(jié)段的脊髓缺血，人體內主動脈夾閉同樣會導致脊髓缺血的發(fā)生［15］。本研究中采用了肖博晗等［16］改進的夾閉大鼠腹主動脈方法建立SCII 模型，實驗技術成熟，操作簡便，損傷效果確實可靠。

SCII 的機制尚不明確，損傷過程可分為直接損傷和間接損傷，其發(fā)生、發(fā)展可能為多因素聯合作用。直接損傷主要發(fā)生在缺血過程中，再灌注損傷多為間接性損傷，間接損傷又稱為繼發(fā)性損傷，主要損傷因素為內源性物質的激活。相關研究認為，氧自由基介導的脂質過氧化反應、鈣離子超載、細胞凋亡、興奮性氨基酸釋放在SCII 中發(fā)揮了重要作用［17］。目前SCII 在臨床中的主要治療手段包括缺血預適應，低溫、低流、低壓再灌注，藥物治療以及物理治療等［18-19］，但是都不能從根本上杜絕癱瘓的發(fā)生。而且這些治療方法只能以對癥支持為主，患者住院時間長，花費大，給家庭和社會帶來沉重的負擔。

藥物治療方面，臨床上尚無明確有效的治療藥物。近年來有一些新型藥物相繼被報道有助于SCII神經功能恢復，但治療后神經功能改善效果均不確定，未見臨床廣泛應用報道。目前在脊髓損傷早期，常用的藥物是糖皮質激素，其可減輕炎癥反應和脊髓損傷;而在脊髓損傷后期尚無安全有效的治療藥物，目前的相關研究熱點是應用神經再生因子和神經營養(yǎng)因子如神經生長因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為改善神經功能或作為康復輔助用藥，但尚未取得明顯治療效果。因此，開發(fā)研制一種安全有效解決SCII 的藥物一直是臨床工作研究的重點之一。

近年來，我國學者嘗試將人參皂甙應用到神經系統疾病及損傷的治療中，發(fā)現人參皂甙在腦缺血、血管性癡呆、癲癇等疾病方面可發(fā)揮神經保護作用［20-21］。而目前國內外文獻關于應用人參皂甙治療SCII 的報道鮮見。因此，本研究利用大鼠SCII 模型深入研究了人參皂甙Rb1 對SCII 的保護效應及其可能機制。

實驗顯示利用人參皂甙Rb1 干預SCII 模型大鼠，可顯著改善大鼠后肢功能，實驗組的BBB 評分在各時間點均顯著高于對照組。HE 染色光鏡下觀察實驗組的神經細胞形態(tài)明顯好于對照組。同時，TUNEL 法檢測細胞凋亡發(fā)現，實驗組的細胞凋亡率明顯少于對照組。以上結果提示人參皂甙Rb1 可改善SCII 大鼠的神經功能，減輕SCII 導致的神經元受損，減少脊髓細胞凋亡。具體機制尚需進一步研究。

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