張 朋，曹 緯，周初松，呂 海，蔡進奎，陳 仲

腰椎椎間盤退變突出是脊柱外科常見疾病，通過制備具有天然三維結(jié)構(gòu)的髓核基質(zhì)支架來構(gòu)建組織工程化髓核，可能有助于改變目前主要通過摘除髓核并內(nèi)固定手術(shù)治療的模式［1-3］。到目前為止，髓核組織工程支架材料在物理性能、生物性能與正常髓核相比仍有較大的差距，尚無與髓核結(jié)構(gòu)高度相似且理化性能相近的支架材料。為此，本實驗試圖研究機械振蕩及去污劑濃度對髓核脫細胞程度及其基質(zhì)形態(tài)學(xué)變化的影響［4］，探討制備髓核去細胞支架的方法，為構(gòu)建具有天然髓核基質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織工程化髓核提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和器材

新西蘭兔(南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)，Triton X-100(Amresco)，PBS 緩沖液、HE 染色試劑、脫氧膽酸鈉［羅基(北京)生物技術(shù)有限公司］，恒溫回旋振蕩器(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院中心實驗室)，掃描電鏡(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實驗室)。

1.2 兔髓核的來源

健康成年兔，雌雄不限，重2～3 kg。采用空氣栓塞的方法將兔處死。然后行兔后背正中切口暴露并游離相應(yīng)椎間盤、取出髓核。每段長約0.5 cm，分為7 個組，每組5 塊，行脫細胞處理或作為空白對照，其中2 塊用于石蠟切片，2 塊用于掃描電鏡觀察。

1.3 髓核的預(yù)處理和化學(xué)萃取

先在手術(shù)顯微鏡下去除非髓核組織，然后進行萃取處理。A、B、C、D 4 組的萃取振蕩頻率分別0、80、130、180 r/min，C1、C2、C3 組的去污劑濃度分別為1%、3%、5%，其余各組的濃度均為3%。E 組為對照組，不作處理。萃取步驟:①浸入去離子水中浸泡12 h［5］;②將髓核分別放入相應(yīng)濃度Triton X-100 的PBS 溶液中。室溫振蕩萃取12 h;③用PBS 溶液漂洗3 次，每次45 min，并用去離子水漂洗2 次，每次1 h;④放入相應(yīng)濃度的脫氧膽酸鈉PBS 溶液中室溫振蕩萃取24 h［5］;⑤PBS 溶液漂洗3 次，每次45 min，并用去離子水漂洗2 次，每次1 h;⑥重復(fù)1～5 操作步驟1次;⑦萃取后的髓核置4℃無菌PBS 溶液(PH 7.4，無鈣鎂)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察

大體觀察:觀察各組標本的外形、色澤、透明度等情況。

HE 染色:用10%的福爾馬林溶液固定，切片后行HE 染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察髓核內(nèi)細胞清除是否完全及基質(zhì)纖維的結(jié)構(gòu)變化。

掃描電鏡:觀察采用25 g/L 的戊二醛和鋨酸固定。經(jīng)干燥和表面噴金后貼片行掃描電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 去細胞髓核支架的大體觀察

肉眼觀，新鮮兔髓核(E 組)柔軟，半透明，成膠凍狀，形態(tài)不固定。經(jīng)去離子水浸泡1 h 后，明顯腫脹;浸泡中的髓核外圍部分可見明顯細絲狀突出，呈絮狀物，透明程度明顯增加(見圖1a，b)。A 組、B組、C1 組經(jīng)去污劑萃取后，去細胞髓核在無離子水中呈絮狀物，外圍帶少量灰白色絲狀突出;取出后呈半透明狀，體積較新鮮髓核(E 組)組織稍變小(見圖1c～e)。C2 組經(jīng)去污劑萃取后，去細胞采集在無離子水中呈絮狀物，外圍帶有多量灰白色絲狀突出，絲狀物直徑變小、變扁;髓核取出后呈半透明狀(見圖1f)。C3 組與D 組去細胞髓核明顯破損，絲狀物斷裂、脫落，更加不規(guī)則;取出后髓核的透明程度增加，但與新鮮髓核(E 組)相比，形態(tài)散亂、總體積變小(見圖1g，h)。

2.2 去細胞髓核支架的顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1 HE 染色切片觀察

圖1 髓核去細胞支架大體觀察Fig.1 Microscopic appearance of the accellular nucleus pulposus scaffold

新鮮髓核(E 組)層次分明，結(jié)構(gòu)緊密，整個髓核視野內(nèi)均可見大量細胞結(jié)構(gòu)，細胞邊界清楚，胞漿和周圍的纖維結(jié)締組織紅染。結(jié)締組織彼此交聯(lián)，境界清晰、銳利，呈均勻分布的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖2a)。髓核經(jīng)去污劑萃取后，著色較淡，A、B、C、D 各組的髓核內(nèi)的細胞基本清除或者殘存部分脫核細胞殘株，可見大量無細胞核的“空泡狀”結(jié)構(gòu)。A 組、B 組和C1 組髓核內(nèi)細胞清除不完全，可見較多胞漿紅染的脫核的細胞殘株，可見大量成束分布的基質(zhì)纖維，形態(tài)不規(guī)則，彼此交織成網(wǎng)狀，可見數(shù)個藍染的核物質(zhì)顆粒(見圖2b～d);C2 組髓核內(nèi)細胞清除非常完全，層次結(jié)構(gòu)消失，未見細胞結(jié)構(gòu)殘留及藍染核物質(zhì)顆粒，僅可見網(wǎng)狀排列的淡紅色基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)(見圖2e);C3 組和D 組與C2 組鏡下觀相似，但髓核外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)紊亂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不清晰，有較明顯損害(見圖2f，g)。

2.2.2 掃描電鏡觀察

正常髓核組織(E 組)可見大量髓核細胞，形態(tài)為圓形或者橢圓形(見圖3a);細胞外基質(zhì)纖維清晰可見，排列成交織的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖3b)。A 組、B 組及C1 組去細胞髓核內(nèi)基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)清晰，呈網(wǎng)狀排列的細胞外基質(zhì)纖維間殘存大量脫核的細胞殘株碎片(見圖3c～e)。C2 組經(jīng)去污劑萃取后，髓核內(nèi)細胞幾乎完全消失，視野內(nèi)由網(wǎng)狀排列的細胞外基質(zhì)纖維構(gòu)成，可見基質(zhì)纖維呈縱行、橫行交織排列成網(wǎng)格狀(見圖3f)。C3 組和D 組脫細胞髓核內(nèi)未見細胞結(jié)構(gòu)，細胞外基質(zhì)纖維亦呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是結(jié)構(gòu)紊亂，其三維空間結(jié)構(gòu)塌陷，其纖維條的直徑未見明顯變化，但可見較多的基質(zhì)纖維扭曲和斷裂(見圖3g，h)。

3 討 論

以支架材料進行動物椎間盤退變(以髓核組織為主)修復(fù)的報道較多，但治療或者逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的療效尚未獲得實質(zhì)性的突破，其中原因之一可能是缺乏天然的與髓核細胞生長環(huán)境高度一致的支架材料，影響了髓核細胞的增殖、分化進程［6］。理想的去細胞髓核支架應(yīng)保留天然的髓核基質(zhì)纖維骨架，且去除細胞等主要抗原成分，消除引起免疫反應(yīng)的主要因素，為植入細胞的存活、增殖、分化提供良好的細胞微環(huán)境。近年來，有關(guān)新的理化方法制備脫細胞基質(zhì)材料以及除垢工藝的進展，為進一步提高脫細胞基質(zhì)材料的制備工藝及質(zhì)量提供了新的思路。國內(nèi)已有非髓核組織脫細胞方法的研究報道，本研究運用文獻［7-8］所用脫細胞方法，并加以改進，采用Triton X-100 和脫氧膽酸鈉聯(lián)合脫細胞。Triton X-100 屬于非離子型表面活性劑，在溶液中穩(wěn)定性高，能與生物膜中的磷脂等脂質(zhì)結(jié)合形成可溶性復(fù)合物。Triton X-100 中的疏水端也能和膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，溶解于溶液中。因此Triton X-100 能徹底破壞生物膜，從而使細胞溶解破壞，使細胞內(nèi)的成分充分釋放出來，達到去除髓核細胞成份的目的。脫氧膽酸鈉為陰離子去垢劑，即陰離子型表面活性劑，是一種效力較強的化學(xué)消化劑，可進一步破壞細胞，并消化降解細胞碎片。非離子型去污劑在保存外基質(zhì)方面效果較好，陰離子型和陽離子型去污劑在去除細胞方面效果較好。為此，本實驗在前人去污劑萃取方法的基礎(chǔ)上加以改進，觀察在不同的機械振蕩頻率及不同去污劑濃度的作用下，髓核去細胞程度及其基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞程度，探討髓核去細胞支架的制備方法［9-10］。

圖2 髓核去細胞支架石蠟切片(HE 染色，×20)Fig.2 Microscopic appearance of the accellular nucleus pulposus scaffold (HE staining，×20)

圖3 髓核去細胞支架的掃描電鏡圖(b-h×10 000，a×5 000)Fig.3 Morphology of the acellular nucleus pulposus observed by acsnning electron microscope (b-h×10 000，a×5 000)

本實驗是在去離子水浸泡、給予低滲環(huán)境輕度破壞髓核細胞的基礎(chǔ)上，設(shè)計使用不同濃度的Triton X-100與脫氧膽酸鈉在不同震蕩頻率條件下聯(lián)合脫細胞，發(fā)揮兩者高效脫細胞的優(yōu)勢，增加脫細胞的效率，對處理后的支架材料做大體觀察、掃描電鏡、組織學(xué)觀察，探索去污劑法最佳的適合髓核脫細胞方案。研究表明，應(yīng)用體積分數(shù)為3% Triton X-100與3%的脫氧膽酸鈉在130 r/min 的轉(zhuǎn)速條件下，可以將髓核細胞較徹底清除，且較完好地保留髓核組織的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

化學(xué)萃取制備髓核去細胞支架的原則主要去除細胞等主要抗原物質(zhì)的同時，盡可能保留基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。目前尚未見用去污劑對髓核組織進行脫細胞制備天然支架的相關(guān)報道。Sondell 等［4］用Triton X-100和脫氧膽酸鈉成功制備大鼠坐骨神經(jīng)去細胞支架，清除了神經(jīng)組織內(nèi)所有細胞成分，保留了細胞外基質(zhì)支架成分。

使用去污劑制備去細胞支架的效果主要取決于選擇合適的去污劑，此外，去污劑濃度、萃取溫度、時間以及機械振蕩也是影響去細胞效果的因素。本實驗組借鑒Sondell 等［4］的化學(xué)萃取法并加以改進，且附加了不同頻率的機械振動以及不同濃度的去污劑。實驗結(jié)果表明在去污劑體積分數(shù)為3%的條件下，當(dāng)機械振動頻率為0 或者80 r/min 時，經(jīng)脫細胞處理的支架中仍有大量細胞或者細胞沉淀物殘留。當(dāng)機械振蕩頻率為130r/min 時，髓核內(nèi)細胞成分清除徹底，且支架的外基質(zhì)成分形態(tài)在大體及鏡下皆保持良好，無明顯損毀。但是振動頻率增大為180r/min 時，髓核內(nèi)細胞雖然清除徹底，但髓核已明顯破損，鏡下可見基質(zhì)纖維排列紊亂，出現(xiàn)明顯的斷裂，基質(zhì)纖維的三維空間存在較嚴重的破壞。由此得出:①在無機械振蕩或振蕩頻率比較低時，髓核細胞可以被清除，但是清除率有限;②在一定頻率范圍內(nèi)，適宜的機械振蕩頻率可以促進髓核內(nèi)細胞成分的清除，這可能與髓核組織結(jié)構(gòu)疏松、細胞間連結(jié)松散有直接關(guān)系，而且去污劑在髓核組織中擴散，利于其發(fā)揮脫細胞作用，但過強的振動頻率則會對細胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)造成一定破壞［11］;③適當(dāng)?shù)娜ノ蹌舛燃扔欣谒韬思毎那宄?，同時也不會對基質(zhì)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成破壞;但是濃度過低髓核細胞清除不徹底，濃度過高則同樣會對髓核外基質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成破壞。

綜上所述，去污劑的濃度及機械震蕩是影響髓核去細胞支架制備效果的重要因素，適當(dāng)?shù)臋C械震蕩頻率以及合理的去污劑濃度有利于徹底去除髓核細胞等抗原成分，且有利于保存髓核外基質(zhì)的三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為植入細胞的存活、增殖、分化以及細胞外基質(zhì)的再生提供高度仿生的三維空間微環(huán)境。為構(gòu)建理想的組織工程化髓核仍需進一步進行免疫組織相容性［12-13］等方面的研究。

［1］Liu C，Xia Z，Czernuszka JT.Design and development of threedimensional scaffolds for tissue engineering［J］.Chem Eng Resand Des，2007，85(A7):1051-1064.

［2］Chadderdon RC，Shimer AL，Gilbertson LG，et al.Advances in gene therapy for intervertebral disc degeneration［J］.Spine J，2004，4(6 Suppl):341-347.

［3］Nomura T，Mochida J，Okuma M，et al.Nucleus pulposus allograft retards intervertebral disc degeneration［J］.Clin Orthop Relat Res，2001(389):94-101.

［4］Scondell M，Lundborg G，Kanje M.Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction［J］.Brain Res，1998，795(1-2):44-54.

［5］李康杰，孫抒.去除移植免疫反應(yīng)抗原成分脫細胞天然骨基質(zhì)的制備［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(8):1355-1359.

［6］Sell S，Barnes C，Smith M，et al.Extracellular matrix regenerated:tissue engineering via electrospun biomimetic nanofibers［J］.Polym Int，2007，56(11):1349-1360.

［7］Hudson TW，Liu SY，Schmidt CE.Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing［J］.Tissue Eng，2004，10(9-10):1346-1358.

［8］Hudson TW，Zawko S，Deister C，et al.Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］.Tissue Eng，2004，10(11-12):1641-1651.

［9］Falke G，Yoo JJ，Kwon TG，et al.Formation of corporal tissue architecture in vivo using human cavernosal muscle and endothelial cells seeded on collagen matrices［J］.Tissue Eng，2003，9(5):871-879.

［10］Freytes DO，Badylak SF，Webster TJ，et al.Biaxial strength of multilaminated extracellular matrix scaffolds［J］.Biomaterials，2004，25(12):2353-2361.

［11］Yin WH，Jin DD，Deng XY，et al.Effects of mechanical vibration on the morphology of the acellular scaffold for the spinal cord［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2008，28(10):1748-1751.

［12］許國華，葉曉健，袁文，等.納米氧化鋯磷酸鈣骨支架體內(nèi)免疫及相容性研究［J］.脊柱外科雜志，2007，5(5):302-304.

［13］呂宏，施杞，王擁軍，等.兔成骨細胞與納米氧化鋯強韌化高孔隙率磷酸鈣人工骨細胞支架生物相容性研究［J］.脊柱外科雜志，2004，2(4):209-212.