陳文靜, 滕 奇, 王崇益

(江蘇正大清江制藥有限公司, 江蘇 淮安 223001)

HPLC-ELSD法測定清開靈滴丸中膽酸和豬去氧膽酸的含量

陳文靜, 滕 奇, 王崇益

(江蘇正大清江制藥有限公司, 江蘇 淮安 223001)

建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)測定清開靈滴丸中膽酸和豬去氧膽酸含量的方法．采用漢邦C18色譜柱(200mm×4.6mm,5μm),流動相為0.1%甲酸-甲醇-乙腈溶液(25∶60∶15),柱溫30℃,漂移管溫度為105℃,空氣流速2.2L/min．膽酸和豬去氧膽酸的進(jìn)樣濃度分別在0.598～1.596mg/mL(r=0.9992)和0.600～0.1.600mg/mL(r=0.9995)范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好,膽酸和豬去氧膽酸平均回收率分別為99.74%和99.21%．該方法準(zhǔn)確,簡便,分離度高,重現(xiàn)性好,可用于清開靈滴丸中膽酸和豬去氧膽酸含量的測定．

HPLC-ELSD法; 清開靈滴丸; 膽酸; 豬去氧膽酸; 含量測定

0 引言

清開靈滴丸是由膽酸、珍珠母、板藍(lán)根、黃芩苷、金銀花、豬去氧膽酸、黃芩、水牛角等八味中藥材,經(jīng)過中藥提取、固體制劑等生產(chǎn)工藝制成棕褐色的滴丸．功能主治為清熱解毒,鎮(zhèn)靜安神．用于外感風(fēng)熱時毒,火毒內(nèi)盛所致高熱不退,煩躁不安,咽喉腫痛,舌質(zhì)紅絳、苔黃、脈數(shù)者;上呼吸道感染,病毒性感冒,急性化膿性扁桃體炎,急性咽炎,急性氣管炎,高熱等病癥屬上述證候者[1]．膽酸和豬去氧膽酸含量測定是清開靈滴丸質(zhì)量控制項目之一,現(xiàn)有的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中膽酸和豬去氧膽酸含量測定分別在高效液相色譜-紫外檢測和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測兩個系統(tǒng)檢測．筆者根據(jù)文獻(xiàn)[2-5]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法把膽酸和豬去氧膽酸含量測定放在一個系統(tǒng)中檢測．實驗結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確,簡便,分離度高,重現(xiàn)性好,可為保障藥品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)．

1 儀器與試劑

1.1 儀器

seriesII泵(Lab Alliance美國);PL-ELS2100蒸發(fā)光散色檢測器(英國Polymer Labotaries);CA3無油空氣泵(武漢科林科技公司);Hanbon Lichrospher C18色譜柱(200mm×4.6mm,5μm);HEATER AB-230A柱溫箱;浙江大學(xué)N2000色譜工作站．

1.2 試劑

甲醇為色譜純(漢邦科技有限公司,批號82456);甲酸為分析純(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);色譜用水為超純水;膽酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號10087-200414),豬去氧膽酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號10087-200610).

1.3 樣品

清開靈滴丸(江蘇正大清江制藥有限公司,批號080418,080419,080420)．

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0.1%甲酸-甲醇-乙腈溶液(25∶60∶15) 為流動相;柱溫30℃．用蒸發(fā)光散射檢測器檢測,漂移管溫度為105℃;氣體流速2.2L/min．理論板數(shù)按膽酸峰計算應(yīng)不低于2000,膽酸和豬去氧膽酸的分離度不小于1.5,進(jìn)樣品20μL．

2.2 對照品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取膽酸、豬去氧膽酸對照品適量,加甲醇溶解,制成每1mL含膽酸0.8mg、豬去氧膽酸0.8mg的混合對照品溶液,和每1mL含膽酸1.6mg、豬去氧膽酸1.6mg的混合對照品溶液．

2.3 供試品溶液的制備

取清開靈滴丸細(xì)粉5.0g,準(zhǔn)確稱定,置于具塞錐形瓶中．加甲醇25mL,稱定重量,超聲處理20min,放冷至室溫．再稱定重量,加甲醇補足減失的重量．搖勻,濾過,棄去初濾液,準(zhǔn)確吸取濾液3mL至10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得．

2.4 陰性對照溶液的制備

按清開靈滴丸制備過程,缺膽酸和豬去氧膽酸的陰性樣品,取5.0g 按本文方法制備陰性對照溶液．

2.5 測定方法

分別準(zhǔn)確吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL分別注入液相色譜儀,測定峰面積,以外標(biāo)二點法對數(shù)方程計算,即得．

2.6 專屬性

分別準(zhǔn)確移取溶劑、混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，注入液相色譜儀,記錄圖譜．兩個相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,其他雜質(zhì)成分對樣品檢測無干擾．實驗結(jié)果表明，該方法的專屬性良好．

2.7 線性關(guān)系檢測

準(zhǔn)確稱取膽酸、豬去氧膽酸適量,用甲醇制備成濃度分別為 0.6,0.8,1.0,1.2和1.6mg/mL的對照品溶液．各準(zhǔn)確量取20μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,測定峰面積,以峰面積值log(A)為縱坐標(biāo),對照品進(jìn)樣濃度log(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,膽酸的回歸方程見表1.

表1 線性關(guān)系檢測結(jié)果

2.8 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取膽酸和豬去氧膽酸對照品溶液,進(jìn)樣20μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定峰面積,膽酸和豬去氧膽酸RSD分別為1.27%和0.92%

2.9 重現(xiàn)性試驗

取同一批樣品,按選定方法制備供試品溶液6份,分別注入液相色譜儀測定含量,膽酸和豬去氧膽酸的RSD(n=6)分別為0.52%和0.75%．

2.10 穩(wěn)定性試驗

準(zhǔn)確吸取供試品溶液,分別于0，3，6，9，12和24h,進(jìn)樣,記錄峰面積,結(jié)果膽酸和豬去氧膽酸RSD(n=6)分別為1.57%和1.25%．

2.11 加標(biāo)回收率試驗

準(zhǔn)確稱取膽酸和豬去氧膽酸的陰性樣品5.0g,分別置于9個具塞錐形瓶中．再在上述具塞錐形瓶中準(zhǔn)確加入一定量的膽酸,豬去氧膽酸．做為約含標(biāo)示量90%、100%和110%的樣品,按選定方法制備供試品溶液．進(jìn)樣測定,計算加樣回收率,結(jié)果見表2和表3．

表2 膽酸的加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

表3 豬去氧膽酸的加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.12 樣品測定

取清開靈滴丸滴丸3批,按照選定方法制備供試品溶液．分別取混合對照品溶液和各供試品溶液進(jìn)樣測定,以外標(biāo)二點法對數(shù)方程計算,結(jié)果見表4.

表4 三個批次樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測器的選擇

《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》中高效液相-紫外檢測清開靈滴丸中膽酸含量[1],采用紫外檢測器,檢測波長為192nm,在近紫外區(qū)測定,膽酸僅有末端吸收,基線漂移較大,檢測結(jié)果受外界條件影響大．但在實際工作中，對0.1mg/mL膽酸,0.1mg/mL豬去氧膽酸的甲醇溶液進(jìn)行紫外掃描發(fā)現(xiàn),膽酸、豬去氧膽酸的甲醇溶液分別在213nm和219nm處有最大吸收,因為常用HPLC級別的甲醇在210nm處紫外吸收值通常為0.5(以1cm石英比色皿水作對照),故此區(qū)域內(nèi)甲醇對樣品的背景吸收很大,容易對樣品測定造成干擾．

雖然在260～400nm范圍內(nèi),色譜級甲醇的紫外吸收值為0.01(以1cm石英比色皿水作對照)可以排除甲醇背景吸收對檢測的干擾,而且膽酸、豬去氧膽酸的甲醇溶液分別另外在264nm和263nm處有較大吸收峰．然而被測樣品清開靈滴丸,由8種中藥材提取,其他多組分在此波長處也有較強吸收,會干擾樣品檢測,影響結(jié)果的準(zhǔn)確度．

綜上考慮,蒸發(fā)光散射檢測器作為一種通用型質(zhì)量檢測器,可有效排除溶劑甲醇對檢測結(jié)果的干擾,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性．高效液相-蒸發(fā)光散射檢測清開靈滴丸中膽酸和豬去氧膽酸含量,在合適的漂移管溫度和氣流下,基線穩(wěn)定,分離效果好,而且膽酸和豬去氧膽酸含量測定在同一測試條件下,操作簡便,重復(fù)性好．故選擇蒸發(fā)光散射檢測器做為本方法的檢測器．

3.2 計算方法的選擇

實驗表明,蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與被測物濃度的關(guān)系曲線比較復(fù)雜,在較高濃度范圍內(nèi)呈線性;而在低濃度范圍內(nèi)會呈指數(shù)關(guān)系．為了考察不同計算方法對準(zhǔn)確度的影響,故將十個批次清開靈滴丸中膽酸、豬去氧膽酸實際含量,用不同計算方法處理測得值，將其結(jié)果進(jìn)行對比．表5和表6分別列舉了用外標(biāo)兩點法直線方程、外標(biāo)一點法直線方程、外標(biāo)兩點法對數(shù)方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理的結(jié)果．

通過數(shù)據(jù)處理對比可知，當(dāng)對照溶液濃度與被測物質(zhì)濃度相差較小時檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較好(膽酸平均回收率95.0%,豬去氧膽酸平均回收率97.5%),但當(dāng)對照溶液濃度與被測物質(zhì)濃度相差較大時檢測結(jié)果準(zhǔn)確度很差(膽酸平均回收率139.2%,豬去氧膽酸平均回收率147.9%),為此采用一點外標(biāo)法計算清開靈滴丸中膽酸、豬去氧膽酸的含量不合適．采用外標(biāo)兩點法直線方程計算結(jié)果準(zhǔn)確度較好(膽酸平均回收率98.8%,豬去氧膽酸平均回收率99.4%),但相比較而言采用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程準(zhǔn)確度更好(膽酸平均回收率100.2%,豬去氧膽酸平均回收率100.3%)．

由此可知,當(dāng)膽酸和豬去氧膽酸進(jìn)樣濃度分別在0.598～1.596mg/mL和 0.600～0.1600mg/mL范圍內(nèi),采用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程法，其濃度的對數(shù)值與各自峰面積值的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系,計算結(jié)果與理論含量最為接近，而且該線性為不通過原點的直線。因而本文采用外標(biāo)兩點對數(shù)法計算供試品的含量．

表5 十個批次膽酸三種計算方法結(jié)果對比表 (%)

注:*膽酸對照溶液濃度為0.598mg/mL；**膽酸對照溶液濃度為1.596mg/mL．

表6 十個批次豬去氧膽酸三種計算方法結(jié)果對比表 (%)

注:*豬去氧膽酸對照溶液濃度為0.600mg/mL；**豬去氧膽酸對照溶液濃度為0.1600mg/mL．

3.3 其他因素對檢測結(jié)果的影響

蒸發(fā)光散射檢測器在使用過程中氣體壓力的波動會對檢測產(chǎn)生影響,因此高效液相-蒸發(fā)光散射檢測要求氣體流速,壓力穩(wěn)定,如果氣源是兩臺或者更多儀器共享,當(dāng)支流氣體流速變小時,高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器測定的峰面積有影響．選用空氣泵做蒸發(fā)光散射檢測器氣源要控制空氣泵輸出的氣壓值波動不能超過±0.05MPa．

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. YBZ00872005國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

[2] 江英橋.HPLC-ELSD法測定清開靈注射液中的膽酸和豬去氧膽酸含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2006,7(4):31-39.

[3] 謝志宏,周壽,汪曉凌,等. HPLC-ELSD法測定清開靈栓中的膽酸和豬去氧膽酸含量[J].中國藥房,2009,20(9):696-702.

[4] 張莉,繆建國. HPLC法測定清開靈注射液中豬去氧膽酸含量[J]. Chinese Journal of Infornation on TCM,2007,14(10):46-52.

[5] 高敏.清開靈滴丸中豬去氧膽酸HPLC含量測定方法.哈爾濱醫(yī)藥[J]. 2008,28(4):45-50.

DeterminationofCholaiicAcudandHyodeoxycholicAcidinQingkailingDiwanbyHPLC-ELSD

CHEN Weng-jin, TENG qi, WANG Chong-yi

(Jiagsu Chiatai Qingjiang Pharmaceutical CO., LTD., Jiagsu Huaian 223001, China)

To establish the contents of Cholaiic Acud and Hyodeoxycholic Acid in Qingkailing Diwan by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection (HPLC-ELSD). Methods: The analytical column was Hanbon Lichrospher C18 column (200mm×4.6mm, 5μm); mobile phase was 0.1% formic acid-methanol-acetonitrile (25∶60∶15); column temperature of 30℃; drift tube temperature of 105℃, flow rate of the air at 2.2L/min. Results: A better linearity and good correlation coefficient were obtained Cholaiic Acud was 0.598～1.596 mg/mL(r=0.9992) and Hyodeoxycholic Acid was 0.600～0.1.600 mg/mL (r=0.9995).Cholaiic Acud and Hyodeoxycholic Acid, average recoveries were 99.74%(RSD=1.4% n=9), 99.21%(RSD=1.0% n=9). Conclusion: The method is accurate, simple, Well-separated, it can be used applicable Cholaiic Acud and Hyodeoxycholic Acid by Qingkailing Diwan.

HPLC-ELSD; qingkailing diwanl; cholaiic acud; hyodeoxycholic acid; content determination

2012-11-02

陳文靜(1965-), 女, 江蘇淮安人, 工程師, 主要從事藥品質(zhì)量檢測.

R286

A

1671-6876(2013)03-0236-04

[責(zé)任編輯蔣海龍]