張玉琳 于紀棉 曾 斌 王靜文 倪晶晶

浙江省寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，浙江 寧波 315104

人臍帶間充質(zhì)干細胞最適宜培養(yǎng)條件研究

張玉琳 于紀棉 曾 斌 王靜文 倪晶晶

浙江省寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，浙江 寧波 315104

目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細胞 （UCMSCs）成功培養(yǎng)擴增的條件，以提高其培養(yǎng)的成功率。方法：無菌條件下采集足月胎兒臍帶6份，分離培養(yǎng)UCMSCs，觀察比較不同的新鮮程度、不同分離方法在相同的培養(yǎng)條件下對UCMSCs培養(yǎng)的影響，并對優(yōu)化條件下培養(yǎng)的UCMSCs進行擴增，評估其貼壁細胞形成集落數(shù)。對培養(yǎng)得到的細胞進行表面抗原標志檢測及其鑒定。結(jié)果：從足月胎兒新鮮臍帶中采用組織塊貼壁的方法，在5%血清濃度的IMDM培養(yǎng)基中，分離培養(yǎng)得到的UCMSCs成功機率最高，且生成集落數(shù)最多為（5.3±0.28）×105／0.5cm臍帶組織，與雙酶法比較存在明顯差異（P＜0.001）；而膠原酶法接種后未見明顯貼壁細胞。培養(yǎng)得到的UCMSCs細胞表面表達MSCs相關抗原CD29，但不表達造血細胞相關抗原CD34，表明此種自臍帶中分離得到并誘導擴增的成纖維樣細胞為間充質(zhì)干細胞。結(jié)論：優(yōu)化UCMSCs的培養(yǎng)條件，成功地建立穩(wěn)定的培養(yǎng)方法，可提高UCMSCs培養(yǎng)成功率，為UCMSCs的實驗研究和臨床應用打下基礎。

臍帶間充質(zhì)干細胞；培養(yǎng)條件

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其具有自我更新、多向分化潛能一直是干細胞的研究熱點。目前研究最多的是在成人骨髓、胎兒臍血中分離培養(yǎng)的MSCs［1］，但研究發(fā)現(xiàn)骨髓源MSCs的含量會隨著年齡的增長而下降，而臍血源MSCs受到倫理道德的影響，培養(yǎng)的成功機率又不高［2］，這些都限制了MSCs在臨床上的應用。近年來，大量的研究已證實在人臍帶中也能分離得到MSCs，即臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs），但由于沒有標準的分離方法及培養(yǎng)條件，使得其成功培養(yǎng)受到限制，尤其是如何穩(wěn)定、高效地從臍帶中獲得MSCs［3］。本研究擬通過比較臍帶的新鮮程度、不同的消化方法的影響，來尋求最佳的培養(yǎng)優(yōu)化條件，以獲得更高的UCMSCs培養(yǎng)成功率。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗所用6份臍帶均來自于寧波市明州醫(yī)院婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦，足月順產(chǎn) （經(jīng)醫(yī)院倫理委員會許可，產(chǎn)婦簽署知情同意書）。待胎兒娩出后，剪下臍帶，置于預先盛有IMDM培養(yǎng)液的無菌瓶中待用。主要試劑：胎牛血清（北京灝洋生物），IMDM（GiBCO），胰蛋白酶、膠原酶、姬姆薩染料、多聚賴氨酸、PHA（Sigma），2－巰基乙醇、氫化可的松、L－谷氨酰胺 （上海源聚生物科技公司），絲裂霉素 （浙江海正藥業(yè)公司），淋巴細胞分離液 （吉林博特生物技術(shù)有限公司），免疫細胞化學試劑盒 （北京邦定泰克生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 臍帶分離方法的比較及對培養(yǎng)得到的UCMSCs進行鑒定 在無菌條件下將臍帶用含100U／Ml慶大霉素的生理鹽水洗滌數(shù)次，剔除臍靜脈與臍動脈，充分沖洗去除血凝塊，然后用剪刀將其剪成約1mm3碎塊，分別采用三種不同的分離方法。即一段采用組織塊貼壁法進行分離培養(yǎng)，另兩段分別采用膠原酶法和雙酶法 （膠原酶加胰蛋白酶法）進行分離。收集懸浮細胞，接種于含5%FCS的IMDM的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3天半量換液1次，待成纖維樣細胞爬出，細胞達到80%匯合時，用0.25%胰蛋白酶進行消化，按1∶3傳代。對上述方法培養(yǎng)的細胞進行觀察記錄，分析比較三種方法對UCMSCs培養(yǎng)的成功率。取第5代的UCMSCs細胞，通過免疫細胞化學的方法檢測UCMSCs表面抗原標志。

1.2.2 臍帶新鮮程度對原代UCMSCs培養(yǎng)的影響 待胎兒娩出后，將臍帶剪下分成3段，其中一段立即采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)UCMSCs，另外兩段放在無菌瓶中分別于－20℃和－70℃凍存，次日將凍存的臍帶快速解凍，再采用組織貼壁法進行細胞培養(yǎng)。3組臍帶均用同一培養(yǎng)基培養(yǎng)，每日觀察記錄。

1.2.3 評估UCMSCs貼壁細胞形成集落數(shù) 將上述分離方法培養(yǎng)的細胞至第14天，移去未貼壁細胞，在倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)瓶底部有集落形成，計數(shù)其形成集落數(shù)，超過50個細胞為一個集落。對三種分離方法得到的集落細胞數(shù)目進行計數(shù)并比較分析。當培養(yǎng)的細胞達到80%匯合時，用0.25%胰蛋白酶進行消化對其進行傳代，以2.5×103／cm2濃度接種，傳至10代，計算每代細胞擴增的倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 （±s）表示，組間比較采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 UCMSCs的鑒定及不同分離方法對其培養(yǎng)的影響 原代培養(yǎng)的細胞約24～48h內(nèi)進行貼壁生長，培養(yǎng)72h后在倒置顯微鏡下可見成纖維樣梭形、多角形細胞出現(xiàn)，當細胞生長達到80%匯合時，對其進行傳代，連續(xù)傳5代，細胞形態(tài)無明顯改變（圖1，2）。對培養(yǎng)第5代的UCMSCs進行免疫細胞化學檢測的結(jié)果顯示其表面抗原標志CD29呈陽性，而造血細胞系的表面抗原標志CD34為陰性 （圖3）。這與臍血源MSCs的表面抗原標記相一致［4］。足月新鮮的臍帶在相同的培養(yǎng)條件下，其中6份臍帶中采用組織塊貼壁法成功分離出中MSCs，成功率為100%；而采用雙酶法（膠原酶加胰蛋白酶法）進行分離的成功率為66.67%，用膠原酶法消化接種后未見明顯貼壁細胞，見表1。

表1 不同消化方法對臍帶MSCs培養(yǎng)的影響（n＝6）

2.2 不同新鮮程度的臍帶對UCMSCs培養(yǎng)的影響 足月新鮮的臍帶采用適當?shù)姆蛛x方法均能成功地培養(yǎng)出UCMSCs，而于－20℃和－70℃將臍帶凍存，次日快速解凍，再進行分離培養(yǎng)的臍帶在培養(yǎng)4周左右均未見MSCs樣細胞出現(xiàn)（圖4）。

2.3 UCMSCs貼壁細胞形成集落數(shù) 按上述方法常規(guī)培養(yǎng)至第14天，移去未貼壁細胞，倒置顯微鏡下可見組織塊貼壁法和雙酶消化法均可見培養(yǎng)瓶底有由數(shù)十至數(shù)百個紡錘形、梭形、三角形、圓形等細胞組成的集落生成。其中采用組織塊貼壁方法生成集落數(shù)與其他分離方法相比有統(tǒng)計學差異，t＝45.11（P＜0.001），且形成集落數(shù)最多為（5.3±0.28）×105／0.5cm臍帶組織，按照每根臍帶均長為40cm計算，平均可得到原代貼壁細胞4.24×107。對得到的UCMSCs進行傳代，至少可穩(wěn)定傳10代，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)平均每代可擴增6.1倍（t＝2.25，P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 UCMSCs貼壁細胞形成集落數(shù)（n＝6）

3 討論

UCMSCs是MSCs的新生力量，其生物學特征與其他來源MSCs相似，但在增殖能力、CFU－F頻率等方面甚至要優(yōu)于其他來源［5］。因此，UCMSCs作為一種新的種子細胞，在疾病的細胞移植及基因治療中具有良好的的研究和應用前景。Romanov等［6］認為胎兒血液循環(huán)中MSC隨胎兒的成熟，大部分定位在臍靜脈內(nèi)皮下層和胎盤。這可以部分解釋臍帶富含MSC的原因。但是由于其分離方法和培養(yǎng)條件等方面技術(shù)還不成熟，使得UCMSCs的臨床研究相對滯后。近幾年實驗人員在對其研究過程中也體會到從人臍帶中能成功培養(yǎng)出MSCs并不容易，特別是如何穩(wěn)定、高效地從臍帶中獲得MSCs以滿足基礎和臨床研究的需要是一個亟待解決的問題［7］。

本實驗從足月胎兒新鮮臍帶中采用組織塊貼壁的方法，在5%血清濃度的IMDM培養(yǎng)基中，分離培養(yǎng)得到的UCMSCs成功機率最高，且生成集落數(shù)最多為（5.3±0.28）×105／0.5cm臍帶組織。采用雙酶法進行分離所得到的UCMSCs與組織貼壁法分離相比有明顯的差異，遠不如組織貼壁法；而采用膠原酶法進行分離沒有培養(yǎng)出UCMSCs。采用酶消化效果不好的原因可能是臍帶組織中成分比較復雜［8］，酶難以將其消化，也可能是在用酶消化過程中，酶在消化組織分離細胞的同時將細胞也消化了。酶解法雖然獲得細胞數(shù)量大，培養(yǎng)時間短，但細胞純度略低，操作復雜、耗時較長、技術(shù)要求較高，同時還存在對細胞的化學污染和機械操作，同時異源蛋白的引入會增加臨床應用過程中發(fā)生過敏反應的可能性。與此相比，組織塊貼壁法對細胞直接損傷小，原代培養(yǎng)細胞純度高，簡單、經(jīng)濟，能夠更好地保持細胞的活力、減少污染機會，培養(yǎng)體系中幾乎見不到造血干細胞及其他細胞混雜，但所需培養(yǎng)時間長［9］。研究中還發(fā)現(xiàn)臍帶的新鮮程度對MSCs的成功培養(yǎng)也至關重要，新鮮臍帶更利于培養(yǎng)［10］，由于其屬于原始細胞，凍存后不易存活，加之在凍存和解凍過程中與外界接觸時間較長，增加了污染的機率，如果臍帶在凍存過程中處理不當，易使大部分細胞活性喪失，則更難以分離培養(yǎng)出MSCs。

綜上所述，在足月新鮮的臍帶中采用組織貼壁法進行分離可得到較豐富的UCMSCs，且其形態(tài)較一致，細胞成分較純。因此，優(yōu)化UCMSCs的培養(yǎng)條件，成功建立穩(wěn)定的UCMSCs培養(yǎng)方法，可提高UCMSCs培養(yǎng)成功率，為UCMSCs的實驗研究和臨床應用打下基礎。

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Discussion on the best culture conditions of hum an umbilical cord m esenchymal stem cells

ZHANG Yu－Lin，YU JI－Mian，ZENG Bin，WANG Jing－Wen，NIJing－Jing
Department of Human Morphplogy，Ningbo College of Health Sience，Ningbo 315104

Objective：To optimize the culture conditions of human umbilicalmesenchymal stem cells（UCMSCs），and improve the culture achievement ratio.Methods：Umbilical cord were collected from full term deliveries，mesenchymal stem cells（MSCs）were isolated from the umbilical cord.The influences of different dgrees of freshness，separation methods in the same conditions on UCMSCs were oberved，and followed by counted colony numbers.UCMSCswere isolated from umbilical cord，the purity ofMSCswas analyzed by ICC.Results：When the other conditionswere the same，fresh umbilical cord from full－term deliveries，method of tiling the tissue，in the IMDM＋5%FCSmudium had the best results.An 0.5 cm umbilical cord tissues contained（5.3±0.28）×105adhesive cellswere harvested at the primary culture.The cells yields and doubling times in explantation technique group were higher than those in enzymes combination digestion group（P＜0.001）.While therewas no adhesive cells could be found in collagenase digestion group.The cultured cells expressed MSCs－related antigen CD29 but did not express hematopoietic cell antigen CD34.Conclusion To optimize the culture conditions of UCMSCs，can improve the success rate of UCMSCs culture，providing a basis for research and clinical application.

Umbilical cord mesenchymal stem cells；Culture conditions

R329.2

A

1007－8517（2013）11－0031－03

2013.04.05）

浙江省教育廳科研項目課題（編號：Y201226068）。

張玉琳，Email：zhangyulin219＠sohu.com