李建強(qiáng)，石洪凌，肖冬光

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300000；2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

納豆激酶（Nattokinase，NK），也稱Subtilisin是由納豆芽孢桿菌（Bacillus sbtilis natto）產(chǎn)生的一種具有溶栓功能的堿性絲氨酸蛋白酶。是由日本的須見洋行等于 1987年首次在日本傳統(tǒng)食品納豆中發(fā)現(xiàn)提取出來并定名[1]。納豆激酶在體內(nèi)外都具有明顯的溶栓活性。與現(xiàn)有的溶栓劑相比，主要表現(xiàn)在可以口服、半衰期長（2-8 h）、抗原性弱、毒副作用小，藥源廣泛，在胃腸道pH環(huán)境中仍能保持活性，既直接作用于纖維蛋白，溶解血栓的主要成分纖維蛋白，又可間接激活體內(nèi)的纖溶酶原，從而使其成為目前發(fā)現(xiàn)的100多種具有口服纖溶作用的物質(zhì)中最具潛力的纖溶蛋白酶[2]。

目前，國內(nèi)外對納豆激酶的研究主要集中在以下幾個方面：通過改良菌種和優(yōu)化納豆生產(chǎn)工藝等方法來提高納豆中納豆激酶活性[3,4]；對納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵條件優(yōu)化，納豆激酶的提取純化等方面的研究[5,6]；納豆激酶的克隆及其在不同載體中表達(dá)的研究[7]。其中獲得高產(chǎn)菌株是納豆激酶生產(chǎn)的關(guān)鍵。

本研究對一株從腐爛葉片表面分離得到的具有溶血活性的芽孢桿菌進(jìn)行了鑒定。再根據(jù)已知納豆激酶序列設(shè)計引物，克隆納豆激酶基因。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

芽孢桿菌為本課題組在腐爛葉片表面分離純化并保存（LJQ-NK），纖維素平板實(shí)驗(yàn)表明該菌有水解纖維素的作用。質(zhì)粒pUC19，E.coli JM109購自TaKaRa公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基：LB，SOB[8]。

納豆芽孢桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、酵母抽提物5 g、葡萄糖5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g溶于800 mL水中，pH 7.0，定容至1 L，滅菌20 min后備用。

1.1.3 試劑

Taq酶、DNA Marker均購自TaKaRa公司。DNA膠回收試劑盒（Axygen-AP-GX-50）為Axygen公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI已經(jīng)發(fā)表的納豆芽孢桿菌16S rRNA和納豆激酶基因序列。利用Primer 5軟件對基因序列分析，設(shè)計引物（由上海生工生物有限公司合成）如表1所示。

表1 PCR引物列表

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取37 ℃過夜培養(yǎng)物1 ml，5 000 rpm離心10 min，去上清液。沉淀的菌體用無菌水清洗三次。加入800 μl CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65 ℃水浴預(yù)熱），每5 min輕輕震蕩幾次，20 min后12 000 rpm，離心15 min；小心吸取上清液，加入等體積的酚；氯仿（各400 μl）溶液，混勻，4 ℃，12 000 rpm，離心10 min；加入等體積的氯仿，混勻，4 ℃，12 000 rpm，離心10 min；取上清液，加1倍體積異丙醇，-20 ℃沉淀20 min；4 ℃，12 000 rpm，離心10 min；棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；室溫下干燥后，溶于50 μl去離子水中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆??；蚪M提取結(jié)果應(yīng)用1%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.2 目的基因片段的PCR擴(kuò)增

以基因組 DNA為模板分別應(yīng)用表一中的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，28 個循環(huán)；72 ℃，5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳后，用Axygen膠回收試劑盒回收目的PCR產(chǎn)物。然后與pUC19質(zhì)粒鏈接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，挑取白斑，37 ℃培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒，電泳檢測后交予上海生工生物公司進(jìn)行核酸序列測定。

1.2.4 序列同源性分析

利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的Nucleotide-nucleotide BLAST（blastn）程序，提交測序得到序列，同時應(yīng)用DNAMAN軟件分析16S rRNA和NK序列與已報道序列的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

應(yīng)用CTAB法提取芽孢桿菌的基因組DNA，結(jié)果如圖1所示。所得到的DNA分子量遠(yuǎn)大于10 kb，而且電泳條帶單一，無明顯降解?？梢杂糜谶M(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步說明CTAB法可以用于枯草芽孢桿菌的基因組DNA的提取。

圖1 基因組DNA電泳結(jié)果

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以基因組DNA為模板，分別用表1中的引物擴(kuò)增得到相應(yīng)的片段，瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物，分別在1.0 kb和1.2 kb附近有十分明顯的DNA擴(kuò)增帶。與預(yù)期的片段長度相吻合（圖2）。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 16S rRNA 序列測定及分析結(jié)果

所得DNA序列長度為896 bp。將該16S rRNA序列遞交GenBank通過Blast進(jìn)行同源序列檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一共119個親緣關(guān)系相近的序列全部為枯草芽孢桿菌，其中同源性最高的前三個菌株，LJQ-NK與它們都具有99.9%以上的同源性。結(jié)果表明LJQ-NK可能為一株枯草芽孢桿菌。

2.4 納豆激酶基因克隆

圖3 LJQ-NK菌種的納豆激酶序列和已知的納豆激酶（GI 29164926）序列比較結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證LJQ-NK的溶血栓能力是否來自于產(chǎn)生納豆激酶，根據(jù)已報道的納豆激酶序列的全長設(shè)計引物，克隆納豆激酶基因。經(jīng)電泳分析，通過PCR擴(kuò)增得到長度為 1 120 bp的 DNA片段，進(jìn)一步測序分析，結(jié)果表明LJQ-NK中納豆激酶序列與已報道的納豆激酶序列只有兩個堿基序列存在差異，分別為18和1 117。而編碼納豆激酶開放閱讀框的堿基序列完全相同，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明LJQ-NK菌種擁有溶解血栓能力可能是因?yàn)樵摼N能分泌納豆激酶所致。

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展基于16S rRNA具有功能和進(jìn)化上的同源性，以及它們序列進(jìn)化變異頻率緩慢，在整體結(jié)構(gòu)上極端保守并且分子大小適中，攜帶有充分的生物信息，可用來進(jìn)行可靠的系統(tǒng)進(jìn)化分析等特征，結(jié)合PCR擴(kuò)增技術(shù)，建立了通過比較16S rRNA 全部核苷酸序列來確定生物分類地位的方法。該方法具有方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，同時可以從分子的角度來描述不同菌株種內(nèi)之間的差異，是目前在細(xì)菌的系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用的和最常用的方法，對確定新種有重要的作用[9]。本研究根據(jù)已報道的納豆芽孢桿菌的16S rRNA序列設(shè)計引物，克隆得到LJQ-NK菌的片段，通過同源性比對分析，初步鑒定LJQ-NK可能為納豆芽孢桿菌。

1992年，Nakamura等利用鳥槍法首次得到了納豆激酶基因序列信息并進(jìn)行了分析[10]。該基因長1 473 bp，起始密碼子是GTG，納豆激酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域即位于起始密碼子的上游17 bp-11 bp處，該位點(diǎn)是核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列（AAAGGAG）。終止序列為三個連續(xù)的終止密碼子TAA、TAG、TAA，此段終止序列為ρ因子非依賴性終止序列。中間為381個氨基酸組成的閱讀框架，包括29個氨基酸的信號肽，77個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽和275個成熟氨基酸單鏈肽。本研究克隆得到長度為1 120 bp的片段，通過序列分析，與已報道的納豆激酶序列有兩個堿基不同，編碼開放閱讀框的序列完全相同。結(jié)果可以說明，LJQ-NK菌株的溶血栓能力，可能與產(chǎn)生納豆激酶有關(guān)。

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