邢艷玲，張玉環(huán)，廉信

（1.天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院，天津300350；2.天津市中醫(yī)藥研究院，天津300120；3.山東省桓臺縣人民醫(yī)院，桓臺250100）

變應(yīng)性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的IV型變態(tài)反應(yīng)，其發(fā)病機制相當(dāng)復(fù)雜。近年來的研究表明，ACD屬于Th1型疾病，趨化因子及其受體在ACD中具有重要作用[1]。雷公藤多苷屬于非甾體類免疫抑制類藥物，具有顯著的抗炎、免疫抑制等作用，能夠調(diào)整和改善機體的免疫功能，對細(xì)胞免疫和體液免疫均有較強的抑制作用[2]，在臨床工作中應(yīng)用雷公藤多苷治療ACD效果確切，但其具體機制尚未完全明確。γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferon-gamma-inducible protein-10，IP-10）、 嗜 酸 性 粒 細(xì) 胞 趨 化 因 子（Eosinophil chemoattractant chemokine,Eotaxin）都屬于趨化性細(xì)胞因子，IP-10主要表達于Thl型細(xì)胞，Eotaxin主要表達于Th2型細(xì)胞。其與相應(yīng)受體結(jié)合后主要參與效應(yīng)T細(xì)胞的產(chǎn)生、遷移以及活化，來誘導(dǎo)Thl或Th2細(xì)胞免疫。本實驗通過觀察雷公藤多苷對ACD患者PBMC中趨化因子IP-10、Eotaxin mRNA表達的影響，進一步探討雷公藤多苷治療ACD的免疫機制，為臨床治療ACD提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 30例ACD患者來自2010年3月—2012年10月天津市咸水沽醫(yī)院皮膚科門診，其中男11例，女19例，年齡范圍18～72歲，平均年齡（38.47±15.61）歲。

1.1.2 主要儀器及藥物 電泳儀購于美國Amersham公司；實時RT-PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司，PCR擴增儀RG-3000購自澳大利亞Corbett公司；凝膠成像系統(tǒng)（英國UVItec公司）；DEPC液、TRIzol購于Sigma公司；雷公藤多苷，稱10 mg雷公藤多苷溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO），加入9 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液，然后取配好的上述液體0.5 mL，加入到9.5 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中，其濃度為50 mg/L，濾菌分裝。

1.2 試驗方法

1.2.1 外周血淋巴細(xì)胞的分離 取ACD患者外周血5 mL，肝素抗凝，加入等量的Hanks液混勻，移液管吸取稀釋血液加于淋巴細(xì)胞分離液上，保持淋巴細(xì)胞分層液與血樣品之間的界限清晰，2000 r/min離心20 min后，液體分為4層，吸取第二層白膜狀的單個核細(xì)胞層液體，加入5倍量的Hanks液洗滌1次，1000 r/min離心10 min，離心后將沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液。

1.2.2 PBMC抑制率的測定 取上述細(xì)胞懸液分別加入不同濃度的雷公藤多苷（0，0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 mg/L），培養(yǎng)48 h后，分別加入5 g/L的MTT 100 μL 培養(yǎng) 4 h 后加入 DMSO 100 μL，震蕩 10 min后立即置酶標(biāo)儀測吸光度A492 nm值，其中抑制率=[1-（實驗組 A/對照組 A）]×100%。

1.2.3 外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) 取1.2.1中單細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，每孔0.5 mL，根據(jù)MTT試驗結(jié)果，分別加入含有不同濃度雷公藤多苷的RPMI-1640 培養(yǎng)液，使其終濃度分別 5.0，1.0，0.5，0 mg/L，以加有單細(xì)胞懸液而不含有雷公藤多苷的培養(yǎng)液孔為對照組，培養(yǎng)48 h后進行檢測。

1.2.4 細(xì)胞總RNA提取 采用細(xì)胞總RNA Trizol試劑提取RNA，嚴(yán)格按照試劑說明書進行提取，取少量在紫外分光光度計260 nm和280 nm下確定濃度和純度，并在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后進行凝膠成像分析。

1.2.5 ACD患者外周血 PBMC中 IP-10、Eotaxin mRNA的檢測 ①引物設(shè)計與合成：引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計并合成，GAPDH為內(nèi)參基因 ：IP-10：5′-GGCCATCAAGAATTTACTGAAAGC A-3′，5′-TCTGTGGGTCCATCCTTGGAA-3′；Eotaxin：5’-CTCTCCGTAGCAACCCTTTG-3′，5′-TATCCTTGGCCAGTTTGGTC-3′；GAPDH：5′-GCACCGTCAAGGCTAGAAC-3′，5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′。②嚴(yán)格按照實時RT-PCR試劑盒所述方法對ACD患者PBMC中IP-10、Eotaxin mRNA的相對表達量進行測定。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，再根據(jù)一定的閾值取其CT值，2△△CT法測定 IP-10、EotaxinmRNA 的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析進行統(tǒng)計，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC抑制率的測定 不同濃度的雷公藤多苷對PBMC生長均成不同濃度的抑制，并且呈濃度依賴性。隨著雷公藤多苷劑量的增加，對PBMC的生長抑制率顯著上升，其半數(shù)細(xì)胞的抑制劑量（ID50）值約為 10 mg/L。

2.2 雷公藤多苷高、中、低3個濃度組體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA表達明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；雷公藤多苷含藥血清3個濃度組之間比較，IP-10 mRNA表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；雷公藤多苷含藥血清3個濃度組之間及與對照組比較，體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。雷公藤多苷含藥血清可以明顯抑制體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA表達，但與濃度高低無明顯關(guān)系。雷公藤多苷含藥血清對體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表達無影響。

2.3 雷公藤多苷與 IP-10 mRNA、Eotaxin mRNA△CT值的相關(guān)性分析 不同濃度的雷公藤多苷（0、0.5，1.0，5.0 mg/L）與 IP-10 mRNA △CT 值存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.653（P<0.01）,而與 Eotaxin mRNA△CT值無明顯相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。

3 討論

IP-10具有強大的招募中性粒細(xì)胞、促進細(xì)胞因子分泌及抑制部分腫瘤生長等多種生物學(xué)作用。研究表明，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，趨化因子在炎癥細(xì)胞向滑膜組織遷移及活化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，IP-10可與表達在T細(xì)胞表面的趨化因子受體CXCR3結(jié)合促進其活化并向CD4+Th1細(xì)胞方向分化，從而促進炎癥反應(yīng)[3]。Kong等[4]曾報道在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中IP-10水平升高，IP-10水平與疾病的活動度相關(guān)，甚至在抗dsDNA抗體、C3表達較低的時候，IP-10可作為一種監(jiān)測疾病活動的敏感指標(biāo)。因此推測認(rèn)為IP-10可能通過特異性選擇作用于表面CXCR3活性的Th1細(xì)胞，在炎癥觸發(fā)過程中起重要作用，并且可能參與SLE免疫異常和發(fā)病過程。IP-10和Mig在銀屑病患者的皮損中表達持續(xù)上調(diào)[5]，在活動期斑塊型銀屑病的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮浸潤細(xì)胞可測到IP-10，有效治療后IP-10表達減少[6]。免疫動物產(chǎn)生的針對IP-10的自身特異性抗體可抑制白細(xì)胞的遷移，改變自身免疫T細(xì)胞的體外Th1/Th2平衡，并能通過過繼性的轉(zhuǎn)移抑制疾病的發(fā)生[7]。這表明IP-10在T細(xì)胞的極化和功能發(fā)揮中起著不可替代的作用。

表1 雷公藤多苷對ACD患者PBMC IP-10 mRNA表達的影響

哮喘小鼠氣道上皮Eotaxin蛋白及肺組織mRNA的表達明顯高于正常對照組，哮喘小鼠氣道上皮Eotaxin的表達與Eos計數(shù)明顯正相關(guān)，進一步證實了Eotaxin在哮喘氣道黏膜炎癥中起調(diào)控作用[8]。特應(yīng)性皮炎皮損中嗜酸粒細(xì)胞的沉積與Eotaxin和CCR3的mRNA和蛋白表達水平顯著相關(guān)，且血中嗜酸粒細(xì)胞的增加和皮損中Eotaxin的表達相關(guān)[9]，特應(yīng)性皮炎發(fā)病中Th2細(xì)胞亞群占優(yōu)勢已受到廣泛認(rèn)可。有研究表明，Eotaxin在小鼠ACD模型的炎癥皮膚中及TNF-γ和IL-4的誘導(dǎo)下，可以表達大量的Eotaxin mRNA[10]，由此說明Eotaxin在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病的發(fā)病中起著重要作用。雷公藤多苷作用于兒童過敏性紫癜時，能抑制CD4+T細(xì)胞功能，改善CD8+細(xì)胞功能，下調(diào)CD4+/CD8+比值而發(fā)揮臨床效應(yīng)[11]。而在治療銀屑病時，雷公藤多苷卻能使患者外周血中降低的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值升高并恢復(fù)正常[12]，同時，雷公藤可通過上調(diào)IL-10，下調(diào) TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-8 等促炎癥因子的表達，抑制Th1反應(yīng)的啟動，使免疫狀態(tài)由Th1向Th2漂移[13]。有研究認(rèn)為，雷公藤抑制Th1，Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用無特異性[14]。近年來，也有研究表明，雷公藤可能通過抑制趨化因子及受體的表達而抑制炎癥的發(fā)生[15]。

在本試驗中，雷公藤多苷含藥血清高、中、低3個濃度組體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA的表達明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；雷公藤多苷含藥血清3個濃度組之間比較，IP-10mRNA表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；雷公藤多苷含藥血清3個濃度組之間及與對照組比較，體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。雷公藤多苷含藥血清可以明顯抑制體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中IP-10 mRNA的表達，但與濃度高低無明顯關(guān)系。而其對體外培養(yǎng)的ACD患者PBMC中Eotaxin mRNA的表達影響不明顯。故推測雷公藤多苷治療ACD的機制之一可能是通過調(diào)節(jié)IP-10、Eotaxin等趨化性細(xì)胞因子水平，改變細(xì)胞因子的表達，促進Th1/Th2平衡來實現(xiàn)的。

[1] Serra HM,Eberhard Y,Martin AP,et al.Secondary lymphoid tissue chemokine（CCL21）is upregulated in allergic contact dermatitis[J].Int Arch Allergy Immunol,2004,133:64-71.

[2]路鷗，史冬梅.雷公藤內(nèi)酯治療變應(yīng)性接觸性皮炎的機制研究進展[J].山東醫(yī)藥，2008,48（43）:117-118.

[3] 滿斯亮，張麗麗，孫琳，等.趨化因子 CXCL10（IP－10）/CXCR3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及應(yīng)用前景[J].中國老年多器官疾病雜志，2011，10（5）：460－464.

[4]Kong KO，Tan AW，Thong BY，et al.Enhanced expression of interferon-inducible protein-10 correlates with disease activity and clinical manifestations in systemic lupus erythematosus[J].Clin Exp Immunol，2009，156:134-140.

[5] Peitsch MC，Irmler M，F(xiàn)rench LE，et al.Genomic organisation and expression of mouse deoxyribonuclease I[J].Biochem Biophys Res Commun,1995，207:62-68.

[6] Napirei M，Karsunky H，Zevnik B，et al.Features of systemic lupus erythematosus in Dnasel-deficient mice[J].Nat Genet，2000，25：177-181.

[7] 楊士軍，崔建和，薛梅，等.銀屑病患者血清IL-8、IP-10的含量及意義[J].放射免疫學(xué)雜志，2005，18（3）：168－169.

[8] 盛青，何建猷，周愛蓮，等.雷公藤甲素對哮喘小鼠信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6及Eotaxin表達的影響 [J].國際呼吸雜志，2006，26（1）：12－15.

[9] Yawalkar N，Uguccioni M，Seharer J，et al.Enhanced expression of Eotaxin and CCR3 in atopic dermatitis[J].Invest Dermatol，1999,1:43-48.

[10]Vocanson M，Hennino A，Rozieres A，et al.Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis[J].Allergy，2009，64:1699-1714.

[11]白海濤.雷公藤多甙對兒童過敏性紫癜免疫功能的干預(yù)作用[J].實用兒科臨床雜志,2002,17（4）：335-336.

[12]馮文莉，張榮麗，王麗，等.雷公藤多甙對銀屑病患者T淋巴細(xì)胞亞群的作用及意義[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，33（5）：453-455.

[13]Tac X，Lipsky PE.The Chinese anti-inflammatory and immune suppressive herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F[J].Rhemn Dis Clin NoAh Am,2000,26:29-50.

[14]林科雄，王長征，錢桂生.雷公藤多甙對哮喘患者Th1,Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21（1）：22-24.

[15]曹紅楊，明輝，魏錦.雷公藤多甙對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者表達趨化因子的影響[J].四川中醫(yī)，2006，24（10）：21-22.