葉蓉，聶李平，胡小平，黃星濤，江曉君

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳518036）

白癜風(fēng)是一種病因不明的色素脫失性皮膚病，自身免疫學(xué)說越來越受到關(guān)注。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cells，Treg）水平或功能降低可能在白癜風(fēng)發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1-2]，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值的變化可反應(yīng)機(jī)體免疫失調(diào)情況。我們應(yīng)用白芍總苷膠囊（total glucosides of paeony，TGP）聯(lián)合吡美莫司軟膏（pimecrolimus）治療散發(fā)型白癜風(fēng)患者，通過觀察治療前后患者皮損恢復(fù)情況，并檢測外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值和CD4+CD25+Treg水平的變化來評價其治療效果，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 45例散發(fā)型白癜風(fēng)患者來自于我院皮膚科2010年5月—2012年10月門診患者，其中男21例，女24例，年齡18～64歲，平均34.97歲。依據(jù)病程長短分為3組，各組皮損面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學(xué)組修定的《白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)》。所有患者均排除其他自身免疫性疾病、腫瘤及嚴(yán)重心肝腎等器質(zhì)性疾病，女性排除妊娠及哺乳期者，檢測前1個月內(nèi)未接受任何治療，所有患者均簽署相關(guān)知情同意書。治療中如發(fā)生不可耐受的不良反應(yīng)等情況，則終止臨床試驗，該病例不納入統(tǒng)計分析。

1.2 實驗藥物 1%吡美莫司軟膏（愛寧達(dá)）購自德國PharmaNovartis公司，國藥準(zhǔn)字H20050485，規(guī)格15 g/（支·盒）；白芍總苷膠囊（帕夫林）購自寧波立華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20055058，規(guī)格0.3g/粒，36 粒/盒。

1.3 主要試劑和儀器 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）標(biāo)記抗人CD4抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）標(biāo)記抗人CD25抗體、FITC標(biāo)記小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）同型對照及PE標(biāo)記小鼠IgG同型對照的抗體購自美國BioLegnd公司，Simultest IMK Lymphocyte試劑盒購自美國BD公司，紅細(xì)胞裂解液購自上海瑞齊生物技術(shù)有限公司，流式細(xì)胞儀購自美國BeckMAN公司。

1.4 臨床療效判定 45例散發(fā)型白癜風(fēng)患者，均給予白芍總苷膠囊1.2～1.8 g/d聯(lián)合1%吡美莫司軟膏外用，3個月后評價皮損恢復(fù)情況。痊愈：白斑全部消退，恢復(fù)正常膚色；顯效：白斑部分消退或縮小，恢復(fù)正常膚色的面積占皮損面積≥50%；好轉(zhuǎn)：白斑部分消退或縮??；無效：白斑無色素再生或擴(kuò)大。有效率用痊愈和顯效例數(shù)占總例數(shù)的百分比表示。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 采集治療前后患者肘正中靜脈血5 mL，放入肝素化試管中，倒轉(zhuǎn)搖勻，6 h內(nèi)檢測。小心吸取抗凝全血100 μL，分別加抗CD3-FITC、抗 CD4-PE 抗體各 10 μL，充分混勻，室溫避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，充分混勻，室溫避光孵育10 min，至液體透亮，1000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS液2 mL，1000 r/min離心5 min，棄上清，洗滌2次。將細(xì)胞懸浮于0.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗滌液中，振蕩混勻后上流式細(xì)胞儀檢測CD3+CD4+T細(xì)胞。同理用抗CD3-FITC、抗CD8-PE抗體測定CD3+CD8+T細(xì)胞，用抗CD4-FITC、抗CD25-PE抗體測定CD4+CD25+Treg。利用功能軟件得到CD4+/CD8+T細(xì)胞比值及CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，顯著性水平α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組散發(fā)型白癜風(fēng)患者皮損恢復(fù)情況 臨床療效見表1。45例中白芍總苷膠囊劑量第1周均為1.8 g/d，分3次口服，其中12例出現(xiàn)大便次數(shù)明顯增多，第2周劑量減為1.2 g/d，分2次口服，耐受后有4例患者于第3～4周起劑量恢復(fù)為1.8 g/d，余8例維持1.2 g/d。另有4例外用吡美莫司軟膏局部出現(xiàn)紅斑，輕度刺痛，堅持治療1～2周后耐受。

表1 白芍總苷聯(lián)合吡美莫司治療散發(fā)型白癜風(fēng)的臨床療效對比 例

2.2 3組散發(fā)型白癜風(fēng)患者外周血T細(xì)胞變化情況 治療后3組散發(fā)型白癜風(fēng)患者外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值及CD4+CD25+Treg水平均分別高于各組治療前，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。病程＜6個月組患者外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值及CD4+CD25+Treg水平升高程度較另2組明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而病程6個月～2年組比≥2年組升高明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表 3）。

表2 治療前后患者外周血T細(xì)胞變化情況

表3 白芍總苷聯(lián)合吡美莫司對患者CD4+/CD8+T細(xì)胞比值的影響

3 討論

目前白癜風(fēng)治療效果欠佳，皮損易復(fù)發(fā)，需長期反復(fù)治療，因此尋找安全而有效的治療方法，一直是白癜風(fēng)研究的熱點。CD4+CD25+Treg是一群具有免疫抑制及免疫無能作用的T細(xì)胞亞群，對維持機(jī)體免疫自穩(wěn)和免疫耐受有重要作用，其數(shù)量的缺乏或功能的缺陷與多種人類自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3]。Th17能夠誘導(dǎo)某些自身免疫病的發(fā)生，而CD4+CD25+Treg則發(fā)揮著保護(hù)作用[4-5]。Sujino等[6]研究表明，CD4+CD25+Treg能夠抑制Th17向Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，延緩結(jié)腸炎的進(jìn)展。眾多研究表明，白癜風(fēng)患者體內(nèi)存在CD4+/CD8+T細(xì)胞比值和CD4+CD25+Treg水平的下降[7]。

白芍總苷膠囊已廣泛用于干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療，并取得較好的療效[8-9]。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可能通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化，從而調(diào)節(jié)Foxp3啟動子的甲基化狀態(tài)，并激活I(lǐng)FN-γ和IL-2信號通路，最終抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)的自身免疫反應(yīng)。白芍總苷治療白癜風(fēng)效果如何，仍未見報道。

臨床觀察顯示，白芍總苷聯(lián)合吡美莫司軟膏能促進(jìn)散發(fā)型白癜風(fēng)患者皮損的恢復(fù)，病程越短臨床效果越明顯。本實驗還發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能夠一定程度提高患者外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值和CD4+CD25+Treg水平，這兩者在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)中發(fā)揮著重要作用，可能是導(dǎo)致患者皮損恢復(fù)的機(jī)制之一，同時對降低白癜風(fēng)的皮損復(fù)發(fā)也可能起著一定作用。結(jié)果提示這種作用與病程有關(guān)，病程＜6個月者效果明顯優(yōu)于病程≥6個月者。由于白芍總苷具有養(yǎng)血柔肝等作用，可為合并肝功能不全患者提供新的選擇。

綜上所述，白芍總苷可能通過升高白癜風(fēng)患者外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值和CD4+CD25+Treg水平，從而提高患者對維持機(jī)體免疫自穩(wěn)和免疫耐受的能力，進(jìn)而促進(jìn)皮損的愈合，且這種作用隨著病程的增加而減弱。但白芍總苷是如何調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的具體作用機(jī)制仍不清楚，可能通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化而實現(xiàn)這種調(diào)節(jié)[10]，又可能通過何方式與黑素細(xì)胞相互作用等問題，仍有待進(jìn)一步的探討。

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