湯斌，張瑩瑩，楊亞平

(安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

木質(zhì)纖維素在地球上的分布十分廣泛且蘊(yùn)藏量豐富，是最廉價的可再生性生物質(zhì)能源［1］。纖維素酶為多組分酶系，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases，EG)、外 切 葡 聚 糖 酶(cellobiohydralases，CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases，BG)，三者通過協(xié)同作用，分解纖維素獲得各種寡糖以及纖維二糖，最終水解生成葡萄糖等單糖，繼而可運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)制取酒精、醫(yī)藥用品、食品以及其它化工原料等，具有良好的應(yīng)用前景［2－3］。其中，內(nèi)切葡聚糖酶主要對纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)起作用，通過隨機(jī)切割斬?cái)唳?1，4-糖苷鍵，釋放出長度不等的短鏈低聚糖，從而在纖維素的降解過程中起著至關(guān)重要的作用［4－5］。目前，如何提高內(nèi)切葡聚糖酶活力及產(chǎn)量已成為了研究的一大熱點(diǎn)。國內(nèi)外對內(nèi)切葡聚糖酶的研究主要集中于基因克隆表達(dá)和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，現(xiàn)已從多種真菌如里氏木霉、斜臥青霉、米根霉等克隆得到內(nèi)切葡聚糖酶基因，并成功構(gòu)建基因工程菌［6－8］。而對于內(nèi)切葡聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能的研究，尤其是其催化過程中關(guān)鍵基團(tuán)的報(bào)道還較少。

纖維素酶分子通常由纖維素結(jié)合域(CBD)、催化結(jié)構(gòu)域(CD)及長短各異的連接片段(linker)組成［9－10］。CBD 由各種纖維素結(jié)合模塊(CBM)組成，其功能為吸附于纖維素表面并將CD 呈遞到底物之上，以疏解結(jié)晶纖維素的結(jié)構(gòu)［11］;CD 呈現(xiàn)出對底物的特異性，可以獨(dú)立發(fā)揮催化作用［12］。本文從匍枝根霉TP-02 的cDNA 文庫中克隆得到eg2 基因，并對其基因產(chǎn)物EGⅡ的CBM 及CD 的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上確定參與酶解過程的重要?dú)埢?，并對其進(jìn)行突變分析，以期通過基因修飾的手段提高內(nèi)切葡聚糖酶的催化活力。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

匍枝根霉TP-02 菌株由本實(shí)驗(yàn)室從黃山生態(tài)林的腐木中分離并保存;大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 菌株和pET28a 質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物均由上海生工合成。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

Trizol 試劑、mRNA 抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒均購自上海生工，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA 連接酶及各種限制性內(nèi)切酶均購于TaKaRa 公司(大連)。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基:CMC-Na 0.4%，KH2PO40.2%，(NH4)2SO40.14%，尿素、MgSO4和CaCl2各0.03%，微量元素(FeSO45 mg/L，MnSO41.5 mg/L，ZnSO41.4 mg/L，CoCl22.0 mg/L，蛋白胨0.75 mg/L，酵母膏0.25 mg/L)。篩選培養(yǎng)基(CMC-Na):CMC-Na 1.5%，(NH4)2SO40.3%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂2%。含剛果紅篩選培養(yǎng)基:配制10 mg/mL 剛果紅溶液，滅菌后按1 mL/200 mL 的比例加到CMC-Na 篩選培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。

PDA 培養(yǎng)基及LB 培養(yǎng)基配方參見分子克隆指南。

1.3 PCR 擴(kuò)增eg2 基因

將匍枝根霉TP-02 擴(kuò)大培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)72 h 后離心收集菌體，進(jìn)行冷凍干燥。取100 mg 菌絲體在預(yù)冷的研缽中快速研磨，利用Trizol試劑提取總RNA，并根據(jù)試劑盒法純化mRNA，以其為模板利用cDNA 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因，其上下游引物分別為F1 和R1(下劃線所示為酶切位點(diǎn)):

反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸75 s，共30 個循環(huán);72℃終延伸10 min。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性克隆篩選

將純化的PCR 產(chǎn)物和pET28a 質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28a-eg2。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 中，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L 涂布于含Kan+的LB 平板上，將形成的單菌落依次點(diǎn)種于含剛果紅的CMC-Na 篩選培養(yǎng)基上，并加入IPTG，37℃培養(yǎng)至長出單菌落，挑取透明圈較大的單菌落保種，用于酶切驗(yàn)證、測序及發(fā)酵性能的研究。

1.5 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性克隆單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.8 左右，加入100 mmol/L 的IPTG 使其終濃度為1 mmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每3 h 取樣，分別取1 mL 菌液，5 000 r/min 離心10 min，去上清液收集菌體，用0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 5.0)重懸細(xì)胞，－80℃反復(fù)凍融進(jìn)行破胞，5 000 r/min 離心30 min，取上清液測酶活，并進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)。

1.6 酶活測定

采用DNS 法測定內(nèi)切葡聚糖酶的活力［13］。酶活定義:在酶的催化下，每分鐘水解CMC-Na 生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量為1 個酶活力國際單位IU。

1.7 eg2 基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

利用PROSITE 數(shù) 據(jù) 庫(http://prosite． expasy．org/)預(yù)測EGII 的主要功能位點(diǎn)，并借助CDD 數(shù)據(jù)庫(http://www． ncbi． nlm． nih． gov/Structure/cdd/wrpsb．cgi)對EGII 氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用ClustalX1.8 軟件對EGII 各保守結(jié)構(gòu)域及其相應(yīng)的同源序列進(jìn)行多序列比對，并用BioEdit 軟件進(jìn)行分析。利用Phyre2 在線分析引擎(http://www．sbg．bio．ic．a(chǎn)c．uk/ ～phyre/index．cgi)完成EGII三級結(jié)構(gòu)的同源建模，并用Discovery Studio 2.5 軟件進(jìn)行分析。

1.8 eg2 的基因修飾

根據(jù)eg2 生物信息學(xué)分析結(jié)果，確定突變位點(diǎn)并設(shè)計(jì)突變組。以pET28a-eg2 為模板，利用重疊PCR完成eg2 基因的修飾。各突變組如表1 所示;各組引物見表2，下劃線為突變位點(diǎn)，其中A1，B1 參與各突變組的PCR 過程。PCR 條件如下:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，54℃/55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共22 ～25 個循環(huán);72℃終延伸10 min。將突變體酶切后與pET28a 連接，測序并轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21，測定各突變株的酶活。

表1 突變組設(shè)計(jì)Tabel 1 Design of mutant groups

表2 重疊PCR 的引物序列Tabel 2 The sequences of primers for overlapping PCR

2 結(jié)果

2.1 eg2 基因的克隆

提取得到高質(zhì)量的總RNA，并從中純化獲得mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用，成功合成匍枝根霉TP-02的cDNA 單鏈，并從中克隆得到一段954 bp 的新型內(nèi)切聚糖酶基因，稱為eg2 基因，將其上傳至Gen-Bank，獲取登錄號為JX315341。雙酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Identification of recombinant plasmid

2.2 陽性克隆篩選

剛果紅與大分子多糖可牢固結(jié)合，隨著多糖分子量的變化，剛果紅結(jié)合程度就會發(fā)生變化，導(dǎo)致顏色從深紅變?yōu)榈S。隨著菌落的長大，CMC 被不斷降解為寡糖，在菌落周圍就會形成透明圈，其大小由CMC 酶的降解能力所決定。透明圈越大，酶活越高。故而能夠快速地分辨出陽性克隆。圖2 所示為陽性克隆所形成的透明圈，空白對照A 在篩選平板上無法正常生長，未形成透明圈。

圖2 剛果紅染色結(jié)果Fig.2 The result of Congo red stain

2.3 EGII 功能位點(diǎn)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

經(jīng)PROSITE 分析，EGII 序列中含有1 個碳水化合物結(jié)合區(qū)(CBM1)，該功能區(qū)的位置為氨基序列的25 ～61 位。CDD 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)歸屬于糖基水解酶第45 家族(Glycoside Hydrolase Family 45)，包含2 個GH45 家族的特征序列，并含有1 個典型的真菌纖維素結(jié)合區(qū)域即CBM1，該纖維素結(jié)合區(qū)域由4 個半胱氨酸構(gòu)成，與PROSITE 預(yù)測結(jié)果一致。

2.4 EGII 氨基酸序列分析結(jié)果

2.4.1 CBM 模塊的比對分析

利用ClustalX 對EGII 的CBM1 序列進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)其在第15 位(即全序列的39 位)上的絲氨酸保守殘基被天冬酰胺所取代，該殘基參與CBM 親水性平面的形成［14］，故該位點(diǎn)的突變可能會導(dǎo)致纖維素酶結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)改變，而對其酶活產(chǎn)生影響。以此確定CBM 的突變位點(diǎn)為N39S。

2.4.2 催化結(jié)構(gòu)域GH45 特征序列分析結(jié)果

內(nèi)切葡聚糖酶的催化區(qū)域通常包含兩個天冬氨酸催化殘基［1，15］，通過序列比對發(fā)現(xiàn)EGII 中相對應(yīng)的位置為136 位和260 位，均被其他殘基所取代，故確定其突變位點(diǎn)為V136D 和E260D。此外，文獻(xiàn)中報(bào)道在催化中心的一側(cè)存在一段loop 環(huán)，該環(huán)能增強(qiáng)催化基團(tuán)周圍環(huán)境的疏水性，阻止除水分子外的各種親核試劑進(jìn)入活性部位［15］。經(jīng)序列比對后，確定該loop 環(huán)的突變位點(diǎn)為T251G、D255G 和P256S。利用Phyre2 完成EGII 的催化區(qū)GH45 及其突變體的三維建模，結(jié)果如圖3 所示。催化殘基V136D 及E260D 的突變形成拉近了兩者的距離，以其為中心的活性區(qū)域發(fā)生改變。此外，對位于V136 和E260 中間的一段loop 環(huán)進(jìn)行改造，T251G、D255G 及P256S的突變形成使得該loop 環(huán)移至活性中心一側(cè)，同時改變催化殘基D260 的空間位置。

2.5 發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)

將含eg2 基因的大腸桿菌重組菌及各突變株接到LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔3 h 取樣測CMC 酶活，結(jié)果如圖4 所示。EGⅡ-A 至EGⅡ-F 的最高酶活分別為0.897 IU/mL，1.114 IU/mL，1.286 IU/mL，0.868 IU/mL，1.215 IU/mL 和1.321 IU/mL。各突變株的酶活均高于原始菌株，其中EGⅡ-F 的酶活比EGⅡ(0.723 IU/mL)提高了82.7%。含CBM1突變位點(diǎn)N39S 的突變株EGⅡ-A、EGⅡ-B 和EGⅡ-F比其他重組菌更早達(dá)到峰值，而所有含V136D 及E260D 的突變株均具有較高的酶活。單獨(dú)對loop 環(huán)進(jìn)行突變的重組菌EGⅡ-C 酶活較低。

2.6 SDS-PAGE

取以上酶活達(dá)到峰值時的發(fā)酵液進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，以未誘導(dǎo)的EGⅡ?yàn)榭瞻讓φ?，結(jié)果如圖5 所示。表達(dá)條帶的分子量大小約為45 kDa，與理論值相符。其中，EGⅡ-E 和EGⅡ-F 的表達(dá)條帶較粗，表達(dá)量相對較高。

圖3 GH45 三級結(jié)構(gòu)模型Fig.3 Tertiary structure of GH45 domain

圖4 重組菌的發(fā)酵特性Fig.4 Fermentation characteristics of different recombinant E. coli BL21

圖5 SDS-PAGE 結(jié)果Fig.5 Results of SDS-PAGE.

3 討論

本文成功克隆了匍枝根霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的表達(dá)，對其結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)纖維素結(jié)合模塊CBM1 和催化結(jié)構(gòu)域GH45 區(qū)在纖維素降解過程中起著關(guān)鍵作用。突變分析結(jié)果顯示，N39S 突變的形成可能會對CBM1與纖維素結(jié)合能力產(chǎn)生影響，從而改變內(nèi)切葡聚糖酶的水解效率。V136D 及E260D 兩個催化位點(diǎn)的突變形成對酶活有明顯的提高作用，而單獨(dú)對loop 環(huán)進(jìn)行突變只能對酶活產(chǎn)生微弱的影響，即在酶解過程中該loop 環(huán)只起輔助作用。然而，對于CBM1 和GH45結(jié)構(gòu)域的具體作用機(jī)理還不甚明了，后續(xù)研究將著眼于纖維素酶的水解機(jī)制，及各保守殘基在催化過程中所扮演的角色。

［1］ Gowen CM，F(xiàn)ong SS. Exploring biodiversity for cellulosic biofuel production［J］． Chemistry ＆ Biodiversity，2010，7(5):1 086 －1 097.

［2］ Takashima S，Ohno M，Hidaka M，et al. Correlation between cellulose binding and activity of cellulose-binding domain mutants ofHumicola griseacellobiohydrolase Ⅰ［J］．FEBS Letters，2007，581(30):5 891 －5 896.

［3］ 韋小敏. 斜臥青霉胞外蛋白質(zhì)組學(xué)分析與纖維素酶合成調(diào)控機(jī)制研究［D］． 山東大學(xué)，2011:1 －2.

［4］ Nakazawa H，Okada K，Onodera T，et al. Directed evolution of endoglucanaseⅢ(Cel12A)fromTrichoderma reesei［J］． Applied Microbiology Biotechnology，2009，83(4):649 －657.

［5］ 鄭海英，黃平，蔡少麗，等. 特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ基因在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)［J］． 微生物學(xué)通報(bào)，2012，39(2):145 －153.

［6］ Samanta S，Basu A，Halder UC，et al. Characterization ofTrichoderma reeseiendoglucanase Ⅱ expressed heterologously in Pichia pastoris for better bionfinishing and biostoning［J］． J Microbiol，2012，50(3):518 －525.

［7］ 劉韞滔，韓學(xué)鳳，羅澤宇，等. 斜臥青霉L-06 內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆與表達(dá)［J］． 微生物學(xué)通報(bào)，2012，39(5):696 －701.

［8］ Moriya T，Murashima K，Nakane A，et al. Molecular cloning of endo-beta-D-1，4-glucanase genes，rce1，rce2，and rce3，fromRhizopus oryzae［J］． J Bacteriol，2003，185(5):1 749 －1 756.

［9］ Hirvonen M，Papageorgiou AC. Crystal structure of a family 45 endoglucanase fromMelanocarpus albomyces:mechanistic implications based on the free and cellobiose-bound forms［J］． Journal of Molecular Biology，2003，29(3):403 －410.

［10］ 方詡，秦玉琪，李雪芝，等. 纖維素酶與木質(zhì)纖維素生物降解轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展［J］． 生物工程學(xué)報(bào)，2010，26(7):864 －869.

［11］ Carrard G，Koivula A，Soderlund H，et al. Cellulosebinding domains promote hydrolysis of different sites on crystalline cellulose［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(19):10 342 －10 347.

［12］ Warner CD，Camci-Unal G，Pohl NLB，et al. Substrate binding by the catalytic domain and carbohydrate binding module ofRuminococcus flavefaciensFD-1 xyloglucanase/endoglucanase［J］． Industrial ＆ Engineering Chemistry Research，2013(2):30 －36.

［13］ 陳紅漫，張欣，李艷秋，等. 綠色木霉葡聚糖內(nèi)切酶(EGⅠ)基因克隆及在釀酒酵母中的表達(dá)［J］． 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(6):48 －52.

［14］ Kraulis PJ，Clore GM，Nilges M，et al. Determination of the three-dimensional solution structure of the C-terminal domain of cellobiohydrolase I fromTrichoderma reesi. A study using nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical simulated annealing［J］． Biochemistry，1989，28(18):7 241 －7 257.

［15］ Valjakka J，Rouvinen J. Structure of 20K endoglucanase fromMelanocarpus albomycesat 1.8 resolution［J］． Biological Crystallography，2003，59:765 －768.