謝 楠，牟茂森，孫夢瑤，于 翔，高 寧，何慧敏，王曉靜，王綺軒，胥謹(jǐn)慧，胡妍妍，侯穎春

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062）

膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白Annexins超基因家族中的成員，人類的ANXA2結(jié)構(gòu)基因位于15q21～q22．ANXA2由339個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為36kDa，由33kDa的C端結(jié)構(gòu)域和3kDa的N端結(jié)構(gòu)域組成．ANXA2主要以單體和異四聚體（ANXA22／p112）形式存在于人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中［1］．大量研究表明，ANXA2在多種類型的腫瘤中過表達(dá)，其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附、侵潤、增殖、遷移、凋亡等活動(dòng)中起重要作用［2］．

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，ANXA2在人結(jié)直腸癌組織高表達(dá)，可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3］．RNA干擾（RNAi）技術(shù)是研究基因功能的重要方法之一，在腫瘤基因治療方面也具有很大潛力．該技術(shù)通過靶mRNA序列特異雙鏈小RNA分子（19－25bp）介導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的強(qiáng)有力阻斷［4］．本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)直腸癌細(xì)胞（Caco2）為研究對(duì)象，采用RNAi技術(shù)抑制Caco2細(xì)胞中的ANXA2基因表達(dá)，研究ANXA2表達(dá)對(duì)Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為揭示ANXA2在結(jié)直腸癌時(shí)扮演的作用提供外觀形態(tài)學(xué)方面的資料，為以ANXA2為靶基因?qū)θ私Y(jié)直腸癌進(jìn)行基因治療積累實(shí)驗(yàn)資料．

1 材料與方法

1．1 siRNA及其表達(dá)質(zhì)粒

Caco2細(xì)胞株購自美國ATCC；表達(dá)ANXA2特異性siRNA的質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2及錯(cuò)義siRNA對(duì)照質(zhì)粒pU6H1－GFP－siRNASCR由百奧生物技術(shù)有限公司（南通）構(gòu)建合成．

siRNA序列由我們?cè)O(shè)計(jì)，ANXA2特異性siRNA序列：TGTGTGGTGGAGATGACTGA；

錯(cuò)義對(duì)照siRNA序列：GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC．

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

Endo－free Plasmid Mini Kit II為Omega產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素、鏈霉素、慶大霉素及胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品；STranG轉(zhuǎn)染試劑購自南京探求生物技術(shù)公司；電鏡級(jí)戊二醛固定液為Sigma產(chǎn)品．

DMIL LED倒置熒光顯微成像系統(tǒng)：德國徠卡公司；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡：荷蘭FEI公司；K850臨界點(diǎn)干燥儀：英國Emitech公司；E－1010離子濺射鍍膜儀：日本日立公司．

1．3 方法

1．3．1 質(zhì)粒制備 質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2及pU6H1－GFP－siRNASCR的制備參照Endo－free Plasmid Mini Kit II說明書進(jìn)行．

1．3．2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Caco2細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100μg／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素、100μg／mL慶大霉素），于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)．將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1．5×105個(gè)／皿接種于含有無菌蓋玻片的30mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁率達(dá)60%～70%時(shí)將質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2和pU6H1－GFP－siRNASCR分別以每皿4．5μg的用量導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)（S－TranG轉(zhuǎn)染試劑說明書）．設(shè)野生對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染的Caco2）．每24h更換一次培養(yǎng)基．轉(zhuǎn)染60h后，用倒置熒光顯微鏡（激發(fā)光波長為488nm）檢測細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況以估算轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染效率＝綠色熒光細(xì)胞數(shù)／視野下細(xì)胞總數(shù)×100%．

1．3．3 環(huán)境掃描電子顯微鏡制樣 分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120h在各組取出鋪有細(xì)胞的蓋玻片進(jìn)行掃描電鏡制樣：（1）用PBS洗3次，每次5 min；（2）2．5%電鏡級(jí)戊二醛4℃下固定60min；（3）預(yù)冷三蒸水洗3次，每次5min；（3）酒精逐級(jí)（30%，50%，75%，85%，95%，100%，100%）脫水，每級(jí)2min；（4）乙酸異戊酯置換乙醇；（5）臨界點(diǎn)干燥；（6）真空鍍金；（7）環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察，數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集．

2 結(jié)果

2．1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒60h后細(xì)胞GFP的表達(dá)如圖1所示．轉(zhuǎn)染效率＞80%．

圖1 轉(zhuǎn)染60h后Caco2細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)水平（×10）Fig．1 GFP expression in Caco2cells at 60hpost transfection

2．2 環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察

圖2Caco2細(xì)胞環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察Fig．2 ESEM images of Caco2cells

環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，野生對(duì)照組細(xì)胞整體形態(tài)豐滿，表現(xiàn)很好的貼壁狀態(tài)，細(xì)胞多成六邊形或多角形；細(xì)胞表面富致密的微絨毛；幾乎每個(gè)細(xì)胞都有發(fā)達(dá)的多而長的偽足自細(xì)胞膜處伸出到無細(xì)胞區(qū)，并與其它鄰近細(xì)胞伸出的偽足相互緊密嵌合或連接（圖2，A，B）．錯(cuò)義對(duì)照組細(xì)胞（即轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siRNASCR的Caco2細(xì)胞）形態(tài)與野生對(duì)照組細(xì)胞基本一致，且隨時(shí)間延長到120h時(shí)細(xì)胞形態(tài)仍無明顯變化（圖2，C，D，E，F(xiàn)，G）．干擾組細(xì)胞（即轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2的Caco2細(xì)胞）形態(tài)及表面結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)變化，而且這種變化隨時(shí)間延長愈加明顯．轉(zhuǎn)染24h后，干擾組細(xì)胞（圖2，H）與錯(cuò)義對(duì)照組細(xì)胞（圖2，C）相比整體形態(tài)無顯著變化，但細(xì)胞表面微絨毛及偽足結(jié)構(gòu)均略有減少．轉(zhuǎn)染48h后，干擾組細(xì)胞（圖2，I）形態(tài)與錯(cuò)義對(duì)照組細(xì)胞（圖2，D）相比出現(xiàn)較明顯變化，邊界變模糊，細(xì)胞表面微絨毛進(jìn)一步減少，而且細(xì)胞偽足變得更加纖細(xì)并排列更加稀疏．轉(zhuǎn)染72h后，干擾組細(xì)胞（圖2，J）與錯(cuò)義對(duì)照組細(xì)胞（圖2，E）相比邊界變得更加模糊，且細(xì)胞開始變形，細(xì)胞表面微絨毛大量消失，而且偽足明顯變少并多數(shù)斷裂變短，且方向性差．轉(zhuǎn)染96h后，干擾組細(xì)胞（圖2，K）與錯(cuò)義對(duì)照組細(xì)胞（圖2，F(xiàn)）相比，其外形變?yōu)榻咏鼒A形的不規(guī)則形狀，細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞表面微絨毛幾乎全部消失，使細(xì)胞表面趨于光滑，僅有少數(shù)的偽足存在，且偽足長短、粗細(xì)不均，分布雜亂．轉(zhuǎn)染120h后，干擾組細(xì)胞（圖2，L）與錯(cuò)義對(duì)照組細(xì)胞（圖2，G）相比，體積進(jìn)一步縮小，細(xì)胞表面微絨毛及偽足結(jié)構(gòu)均近乎完全消失，另外可見部分細(xì)胞膜區(qū)域出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象．

3 討論

ANXA2作為一種多功能的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，參與許多生命活動(dòng)：調(diào)節(jié)Ca2＋依賴的膜性生物學(xué)活動(dòng)［5］；穩(wěn)定細(xì)胞骨架［6］；促進(jìn)DNA合成及腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［7］；并在血管生成過程中起重要作用［8］．大量研究表明，ANXA2在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)．結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，我們前期研究已證明以ANXA2為靶基因設(shè)計(jì)合成的干擾重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2可在mRNA及蛋白水平顯著下調(diào)ANXA2在Caco2細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而抑制Caco2細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］．在此基礎(chǔ)上，將干擾重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2導(dǎo)入Caco2細(xì)胞后，以掃描電鏡觀察了ANXA2表達(dá)對(duì)Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面超微結(jié)構(gòu)影響．環(huán)境掃描電鏡觀察顯示，Caco2細(xì)胞內(nèi)ANXA2表達(dá)被抑制后，細(xì)胞由伸展性良好的六邊形或多角形逐漸收縮變小，成為圓形或不規(guī)則形狀；細(xì)胞表面微絨毛及偽足等結(jié)構(gòu)的形成受到明顯抑制，并隨時(shí)間延長而加劇，最終Caco2細(xì)胞表面原本十分發(fā)達(dá)的、與細(xì)胞活躍的運(yùn)動(dòng)力相關(guān)的結(jié)構(gòu)幾乎全部消失，細(xì)胞表面趨于光滑．腫瘤細(xì)胞表面大量微絨毛的存在可擴(kuò)張細(xì)胞表面積，增強(qiáng)細(xì)胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換及信息交流；同時(shí)大量微絨毛存在可使細(xì)胞表面粘液不至流失，保持細(xì)胞表面滑潤，減少細(xì)胞所受磨擦及由此造成的細(xì)胞損傷［10］．Caco2細(xì)胞表面微絨毛的減少勢必會(huì)削弱細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的相互作用，使得一些信息在細(xì)胞與環(huán)境間傳遞錯(cuò)誤或中斷；微絨毛減少也將導(dǎo)致細(xì)胞的防御能力下降，從而影響細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，同時(shí)，微絨毛也是細(xì)胞自身的運(yùn)動(dòng)器官之一，故微絨毛的減少也勢必抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)力．發(fā)達(dá)的偽足結(jié)構(gòu)是腫瘤細(xì)胞活躍的運(yùn)動(dòng)力和侵襲力的最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和有別于正常細(xì)胞的明顯特征．偽足對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲、黏附、攝取營養(yǎng)、支持等過程起關(guān)鍵作用，而且對(duì)腫瘤細(xì)胞突破血管壁的基底膜至關(guān)重要［11］，故而是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這種結(jié)構(gòu)受損，必然會(huì)使細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)移能力減弱．

ANXA2的C端結(jié)構(gòu)域含有絲狀肌動(dòng)蛋白（F－actin）結(jié)合位點(diǎn)，其在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架重排、維持肌動(dòng)蛋白骨架可塑性等活動(dòng)中起重要作用［6］．Caco2細(xì)胞ANXA2表達(dá)被抑制后，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Rho蛋白活性降低［12－13］，抑制Rho／ROCK／LIMK／Cofilin通路活化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Cofilin［14］，從而可能導(dǎo)致與F－actin結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白Fascin表達(dá)水平降低［15］．也可能導(dǎo)致AHNAK－ANXA22／p112－F－actin［16］、Src－ANXA22／p112－F－actin［17］、CEACAM1－ANXA22／p112－F－actin［18］、CD44－ANXA22／p112－F－actin［19］等與F－actin活動(dòng)緊密相關(guān)的復(fù)合體形成受阻．通過以上途徑，下調(diào)ANXA2的表達(dá)可能將干擾細(xì)胞內(nèi)F－actin的解聚、重排等正?；顒?dòng)，從而影響細(xì)胞表面以F－actin為主要組分的偽足及微絨毛等突起結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化．同時(shí)，ANXA2表達(dá)被抑制后，還可能通過細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)改變影響細(xì)胞質(zhì)膜的活性及動(dòng)力學(xué)特性［5］，使細(xì)胞收縮變形、黏附性下降．此外，隨轉(zhuǎn)染后時(shí)間的延長，部分細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)褶皺或不完整狀態(tài)，顯示細(xì)胞凋亡現(xiàn)象．這是由于抑制ANXA2表達(dá)可能影響一些凋亡相關(guān)因子（如：前胃泌素、p53等）活性，進(jìn)而觸發(fā)一系列信號(hào)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路［7，20］的啟動(dòng)，從而使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡表型．

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以RNAi技術(shù)抑制ANXA2表達(dá)后，Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化．主要表現(xiàn)為細(xì)胞縮小變形；細(xì)胞表面微絨毛及偽足等突起結(jié)構(gòu)受損，逐漸減少甚至消失；最終一些細(xì)胞出現(xiàn)膜褶皺、不完整等凋亡表型．說明ANXA2表達(dá)與Caco2細(xì)胞表面形態(tài)變化密切相關(guān)，ANXA2在此過程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究．此研究為進(jìn)一步探索ANXA2在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中的作用以及結(jié)直腸癌基因治療提供細(xì)胞形態(tài)方面的依據(jù)．

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