李瑞文 ，林亞秋 ，鄭玉才 ，張潤鋒 ，宮佳琦 ，晁珊珊

1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.成都市第九人民醫(yī)院·成都市婦產(chǎn)科醫(yī)院 生殖與不孕研究所，四川 成都 610091；3.湖北師范學院 生命科學學院，湖北 黃石 435002

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ co?activator-1α，PGC-1α）屬于與能量代謝關系最密切的PGC-1轉錄輔助活化因子家族，最早在酵母雙雜交體系中作為調控脂肪細胞分化的核受體PPARγ的輔激活因子被發(fā)現(xiàn)[1]。PGC-1α主要在能量代謝旺盛或富含線粒體的組織如心臟、肝臟、肌肉、腦、腎和棕色脂肪中表達，具有明顯的組織特異性[2-3]。同時，寒冷、禁食、鍛煉和激素等因素刺激可誘導PGC-1α表達，然后與不同的轉錄因子結合，在不同組織和生物反應過程中發(fā)揮其多種功能。因PGC-1α在機體諸多代謝過程，如肌纖維類型轉化、線粒體生成、氧化代謝、適應性產(chǎn)熱、葡萄糖代謝和肥胖及相關疾病治療[4-7]等中發(fā)揮重要作用，所以成為近年來備受關注的核受體轉錄輔助激活因子。關于PGC-1α的研究多集中于陸生動物，在水生動物中的研究報道較少[8-9]。有報道顯示，PGC-1α在魚類和陸生動物某些方面的調控作用存在差異，如線粒體生成和對溫度的敏感性方面[8-10]。因此，為了解析PGC-1α在魚類和陸上動物中存在的差異，需要首先闡明該基因在魚類中的序列特征。

齊口裂腹魚是我國青藏高原特有的冷水性魚類，屬鯉形目-鯉科-裂腹魚亞科-裂腹魚屬。其肉質細嫩、味道鮮美，賴氨酸含量極為豐富，可作為賴氨酸的天然強化食品，在我國西部及東北地區(qū)的冷水養(yǎng)殖中具有很大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場養(yǎng)殖前景。我們以齊口裂腹魚肌肉組織為研究對象，通過克隆得到PGC-1α基因編碼區(qū)序列，檢測了其在基礎狀態(tài)和禁食狀態(tài)下在白肌和紅肌中的表達情況，為研究PGC-1α在齊口裂腹魚肌肉中的調控作用提供了基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

齊口裂腹魚（500±12 g）購自四川省雅安市蘆山養(yǎng)殖場，運回實驗室后，在養(yǎng)殖單位為300 L的水族箱內用海大牌鯉魚飼料飼養(yǎng)1周后開始正式實驗。實驗用水為曝氣后自來水（pH6.5），實驗期間控制水溫為20±1℃，水體溶氧保持在5.0 mg/L以上。實驗分2組，對照組飼喂商業(yè)飼料，實驗組2周未飼喂任何飼料，2周后取對照組和實驗組齊口裂腹魚的紅肌和白肌組織，置液氮內備用。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD-18T載體、反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq（2×）染料、Taq DNA聚合酶購自大連TaKaRa公司；DNA回收試劑盒購自博大泰克公司。

1.2 齊口裂腹魚PGC-1α基因的克隆與序列分析

嚴格按照Invitrogen公司TRIzol試劑說明書提取齊口裂腹魚紅肌組織的總RNA，用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。用1 μg總RNA進行反轉錄，按照TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0的方法，以 Oligo（dT）為引物合成cDNA第一鏈。根據(jù)GenBank中斑馬魚（Danio re?rio）PGC-1α 基 因 序 列（M_002667531，AY998087，F(xiàn)J710604，DQ017637），用Primer Premier 5.0軟件設計2對PCR引物（包括完整的開放讀框）F1（5'-GGATGGCGTGGGACAGGTGTAATC-3'）、R1（5'-GC TGGGGTGGTGCTGTCTCGTT-3）和 F2（5'-CTGAG CAAGGCGTCCTCCACTATG-3'）、R2（5'-TTACCTTC TCAGGCTGTACTGGG-3'），產(chǎn)物長度分別為 1343、1425 bp，克隆策略見圖1。25 μL PCR反應體系包括超純水 16.375 μL、2.5 mmol/L dNTP 混合液 2 μL、PCR 緩沖液 2.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、cDNA 1.5 μL、25 mol/L 引 物 各 0.5 μL、0.5 U/L Taq DNA聚合酶0.125 μL。PCR條件：94℃預變性5 min；95℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 1.5 min，38個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA回收試劑盒回收目的條帶，回收產(chǎn)物連接pMD-18T載體，轉化后篩選陽性克隆，提取質粒并由上海英駿公司完成DNA測序。測序后采用NCBI的BLAST進行序列同源性比對，用在線軟件（http://www.marksgeneticsoftware.net/）確定轉錄因子結合位點，用MEGA軟件制作物種進化樹。

1.3 半定量RT-PCR檢測禁食狀態(tài)下的基因表達

圖1 齊口裂腹魚PGC-1α基因cDNA的克隆策略

參照1.2的方法提取對照組和禁食組齊口裂腹魚紅肌和白肌組織的總RNA并進行反轉錄。用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)齊口裂腹魚β-actin基因 序 列（JQ013000）和 所 獲 得 的 PGC-1α 序 列（JN195738）設計特異引物βF（GATTCGCTGGAGAT GATGCT）、βR（CGTTGTAGAAGGTGTGATGCC）（長度為219 bp）和 PF（GCTGCCTTGGTTGGTGAA）、PR（CCTTGCCACCTGGGTATTG）（長度為 439 bp），利用半定量RT-PCR檢測PGC-1α基因在紅肌和白肌中的表達情況。PGC-1α基因和β-actin基因PCR反應體系同PGC-1α基因的克隆測序。PCR條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56.8℃ 60 s/54.5℃ 60 s，72℃ 60 s，33個循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Quantity one軟件分析。數(shù)據(jù)用PGC-1α與β-actin條帶的光密度比值表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件分析所得數(shù)據(jù)，用x±s表示；采用t檢驗進行顯著性分析，當P＜0.05時為差異顯著，P＜0.01時差異極顯著。

2 結果

2.1 齊口裂腹魚PGC-1α基因cDNA的克隆及序列分析

按照圖1的克隆策略，采用RT-PCR方法對齊口裂腹魚紅肌中的PGC-1α基因進行擴增，均獲得2條特異區(qū)帶，與預期片段大小一致（圖2）。獲得的特異擴增序列經(jīng)膠回收和雙向測定后，拼接得到其cDNA序列2633 bp（GenBank登錄號為JN195738），其中開放讀框（ORF）為2631 bp，編碼876個氨基酸殘基。轉錄因子結合位點分析表明，該序列包括MyOD、CREB和C/EBP等結合位點。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)N端含有LXXLL（142～146殘基）轉錄激活區(qū)，C端含有一個RNA結合區(qū)域（755～822殘基）和富含絲氨酸/精氨酸的結構域（SR結構域）（646～677殘基）（圖3）。BLAST比對結果顯示齊口裂腹魚的PGC-1α氨基酸序列同GenBank登錄的人、小鼠、大鼠、牛、豬、雞、斑馬魚、草魚、虹鱒、金體美鳊、弓鰭魚、金魚和線翎電鰻的PGC-1α氨基酸序列的同源性為49%～93%，繪制的進化樹見圖4。

圖2 齊口裂腹魚肌肉組織組織PGC-1α基因的RT-PCR結果

2.2 基礎狀態(tài)和禁食狀態(tài)下PGC-1α mRNA表達水平的變化

取對照組和禁食處理2周的實驗組齊口裂腹魚的紅肌和白肌，用半定量RT-PCR檢測PGC-1α mRNA表達水平的變化。結果表明，在基礎狀態(tài)下，PGC-1α在紅肌中的表達顯著高于白肌中（P＜0.05），與對照組相比，在禁食誘導2周的情況下，PGC-1α mRNA在紅肌和白肌中的表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖5）。這一結果證明通過禁食誘導可以顯著提高PGC-1α在肌肉中的表達水平。

3 討論

PGC-1家族包括PGC-1α、PGC-1β和PGC-1相關輔激活因子（PGC-1-related coactivator，PRC）等3個成員，是迄今與能量代謝關系最為密切的轉錄因子家族[2]，在許多脊椎動物如靈長類、嚙齒動物、反芻動物、鳥類、兩棲類和魚類中都存在[11]。但關于PGC-1α在魚類中的序列特征分析尚缺乏。本研究獲得了齊口裂腹魚PGC-1α基因的cDNA序列，轉錄因子結合位點分析發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚具有其他哺乳動物所有的MyOD、CREB、C/EBP等結合位點，但不存在MEF-2和胰島素應答序列（IRS）結合位點。PGC-1α蛋白質序列與其他脊椎動物具有相似的典型結構域，即N端含有LXXLL轉錄激活區(qū)，C端含有RNA結合區(qū)和SR結構域。蛋白質同源性分析發(fā)現(xiàn)，齊口裂腹魚的PGC-1α與同鯉科的草魚、金魚和斑馬魚的同源性較高，分別為93%、91%和88%，但與陸生動物的同源性較低。以上數(shù)據(jù)提示PGC-1α可能在魚類和陸生動物中存在相同和不同的作用。

為了研究PGC-1α在齊口裂腹魚肌肉中的調控作用，我們用半定量RT-PCR方法檢測了其在齊口裂腹魚白肌和紅肌中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在基礎狀態(tài)下，PGC-1α在紅肌中的表達顯著高于白肌中。這與PGC-1α的組織表達特異性相符，因為與白肌相比，紅肌富含線粒體。Tiraby等也指出，PGC-1α在新生兒及哺乳動物的棕色脂肪細胞中的表達量顯著高于白色脂肪細胞[12]，與本實驗結果相一致。對陸上動物，多采用體外誘導PGC-1α表達來研究該基因在肌肉中的功能，如通過運動、溫度等探討其對肌肉線粒體和肌纖維類型轉換的影響，但這2種手段在魚類中難以施展[8-9,13]。我們還檢測了禁食狀態(tài)下PGC-1α在紅肌和白肌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)禁食可以顯著誘導該基因在齊口裂腹魚肌肉中的表達水平，提示可以通過禁食誘導PGC-1α表達，進而檢測與肌肉能量代謝相關基因的變化，最終闡明PGC-1α在肌肉中的調控作用。

圖3 齊口裂腹魚PGC-1α核苷酸序列和推測的氨基酸序列

圖4 齊口裂腹魚PGC-1α氨基酸序列進化樹

圖5 PGC-1α在齊口裂腹魚紅肌和白肌中的表達

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