曹夢(mèng)潔，沈驥冬，程露露，王慧中，吳劍丙

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

石斛幾種拮抗真菌的篩選鑒定

曹夢(mèng)潔，沈驥冬，程露露，王慧中，吳劍丙

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

采用平板分離技術(shù)，從藥用石斛根系中分離獲得內(nèi)生真菌，并通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選對(duì)石斛病原真菌有拮抗作用的菌株，進(jìn)一步利用分子技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分類鑒定.結(jié)果表明：從石斛菌根中共分離獲得2種拮抗真菌，分別屬于黑孢屬(Nigrospora)和葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria).

石斛；內(nèi)生真菌；拮抗真菌

石斛為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物，是我國(guó)十分重要的藥用觀賞植物，民間又稱救命仙草、植物黃金，具有抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力、抗血小板凝集及擴(kuò)張血管等作用[1].石斛是一種典型的菌根共生體植物，自然條件下真菌與石斛根系形成一種特殊的菌根結(jié)構(gòu)，在其生活史中發(fā)揮必不可少的作用.在自然條件下生長(zhǎng)的石斛，其種子萌發(fā)、植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)均需要與內(nèi)生真菌共生，獲得碳水化合物和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-3].同時(shí)，研究者認(rèn)為內(nèi)生真菌作為石斛體內(nèi)的有益優(yōu)勢(shì)菌群，能釋放出拮抗物質(zhì)，有效阻止其它病原菌侵入，增強(qiáng)寄主植物的抗病力[4].因此，篩選對(duì)植物病原真菌有拮抗作用的菌株，用于石斛人工栽培管理，能帶來(lái)巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益.

目前，病原真菌正嚴(yán)重威脅植物生產(chǎn)的安全和穩(wěn)定，甚至造成毀滅性破壞.長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅增加農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，更造成嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留等環(huán)境污染問(wèn)題.實(shí)踐證明，把對(duì)病原真菌具有拮抗活性的植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接到植物體內(nèi)進(jìn)行生物防治，即將拮抗真菌開發(fā)成綠色微生物源農(nóng)藥，是當(dāng)前控制病害發(fā)生和發(fā)展最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的手段，具有廣闊應(yīng)用的前景.本研究采用平板分離技術(shù)，從石斛根系中分離獲得內(nèi)生真菌，通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選對(duì)石斛病原菌有拮抗作用的菌株，進(jìn)一步通過(guò)分子手段，鑒定拮抗真菌種類，為石斛人工栽培管理和綠色農(nóng)藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生石斛和2種石斛病原菌為杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采集保存.

1.2 內(nèi)生真菌分離和純化

取多年生老根及新鮮營(yíng)養(yǎng)根根尖(4～5 cm)，經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后，用75%乙醇消毒60 s.棄乙醇，加入0.1%升汞，滅菌5 min后取出根尖，用無(wú)菌水沖洗3次.在無(wú)菌條件下用解剖刀將根尖橫切成3～5 mm的薄片，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，切面朝向培養(yǎng)基.每個(gè)平板放置組織5塊，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)3 d.

從培養(yǎng)基邊緣挑取菌絲體轉(zhuǎn)移至新鮮PDA平板，重復(fù)至獲得純培養(yǎng)物后，PDA斜面4 ℃保存.

1.3 拮抗真菌篩選

將分離得到的菌株與2種病原菌(赤霉菌Fusariumgraminearum和炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides)分別接種到PDA平板(5 cm)上，平板中心對(duì)稱兩點(diǎn)接種，距離約3 cm，以單獨(dú)接種病原菌的平板作為對(duì)照，每組重復(fù)處理4次.在25 ℃、60%濕度環(huán)境下培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況，計(jì)算拮抗系數(shù)[5].拮抗系數(shù)分為5級(jí)：Ⅰ級(jí)，拮抗菌絲占據(jù)平板的100%；Ⅱ級(jí)拮抗菌絲占據(jù)平板>2/3；Ⅲ級(jí)拮抗菌絲占據(jù)平板<2/3，>1/3；Ⅳ級(jí)拮抗菌絲占據(jù)平板<1/3；Ⅴ級(jí)病原菌占據(jù)平板100%[6].

1.4 拮抗真菌分子鑒定

1.4.1 總DNA提取與電泳檢測(cè)

從平板上刮取約0.1 g菌絲體于1.5 mL離心管中，，加入500 μL裂解緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA、400 mmol/L NaCl和2%SDS)，用電鉆充分研磨后振蕩，室溫靜置10 min，在4 ℃下12 000 rmp離心5 min.取上清液約300 μL，加入1 mL無(wú)水乙醇，在-20 ℃下靜置20 min后， 4 ℃下12 000 rmp離心5 min.棄上清液，用75%的酒精洗沉淀1次，12 000 rmp離心5 min，棄上清并風(fēng)干沉淀.用40 μL ddH2O溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆?

取2 μL DNA樣品在1%瓊脂糖凝膠在電泳120 V，30 min，紫外燈下檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照.

1.4.2 rDNA間隔區(qū)序列的PCR擴(kuò)增

利用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴(kuò)增內(nèi)生真菌rDNA ITS區(qū)段.

PCR反應(yīng)體系為：10×Ex Taq Buffer(含Mg2+)2.5 μL、模板DNA2.0 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 1.5 μL、 ITS1(10 μmol/L) 0.6 μL、 ITS4(10 μmol/L) 0.6 μL 、Taq酶(2 U/μL) 0.4 μL、滅菌ddH2O19 μL.

擴(kuò)增程序?yàn)椋?6 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，35個(gè)反應(yīng)循環(huán),72 ℃延伸5 min.

1.4.3 ITS序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA片段快速純化/回收試劑盒(鼎國(guó)生物有限公司)回收后，連接到PMD18-T 載體(TaKaRa生物有限公司)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH-5α，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定(上海桑尼公司).

1.4.4 ITS序列數(shù)據(jù)分析

采用BlastN方法將獲得的真菌ITS序列與GenBank中的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，認(rèn)為實(shí)驗(yàn)所獲得的真菌與序列同源性最高的真菌為同一屬.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗真菌菌株分離結(jié)果

從多年生老根及新鮮營(yíng)養(yǎng)根根尖共分離得到內(nèi)生真菌22株，編號(hào)為YN12-A，YN12-B，YN12-C，YN12-D，YN12-E，YN12-F，YN12-G，YN12-H，YN12-I，YN12-J，YN12-K，YN12-L，YN12-M，YN12-N，YN12-O，YN12-P，YN12-Q，YN12-R，YN12-S，YN12-T，YN12-U，YN12-V.將22種內(nèi)生真菌分別與赤霉菌和炭疽菌進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果表明，YN12-F和YN12-V與兩種病原菌之間都有明顯的抑菌區(qū)，它們產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)限制了病原菌的進(jìn)一步生長(zhǎng)，而對(duì)照組病原菌生長(zhǎng)良好(圖1).兩種拮抗菌絲占據(jù)平板平面及拮抗系數(shù)均不同(表1).

/%

2.2 拮抗菌株基因的克隆和序列分析

菌株YN12-F測(cè)序獲得大小為987 bp的基因片段，利用NCBI在線生物學(xué)軟件BlastN對(duì)該序列進(jìn)行同源性分析.結(jié)果顯示，與黑孢屬(Nigrospora)真菌稻黑孢菌(N.oryzae)的同源性最高，為99%.

菌株YN12-V測(cè)序獲得大小為972 bp的基因片段，利用NCBI在線生物學(xué)軟件BlastN對(duì)該序列進(jìn)行同源性分析.結(jié)果顯示，與葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)真菌葡萄座腔菌(B.rhodina)同源性最高，為100%.

3 討 論

石斛不僅是藥用植物，而且作為一種觀賞性植物迅速發(fā)展，形成一支重要的園藝產(chǎn)業(yè).由于石斛野生資源遭到嚴(yán)重破壞，人工條件下進(jìn)行大規(guī)模有效地繁殖已成為必然趨勢(shì).此外，每年由病原菌造成的損失達(dá)數(shù)千萬(wàn)元，而用化學(xué)方法對(duì)植物病原真菌進(jìn)行防治會(huì)產(chǎn)生真菌抗藥性，農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)成本的增加，土壤、水體和大氣等環(huán)境的污染及農(nóng)副產(chǎn)品農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，篩選出有益的拮抗菌株將對(duì)提高人工栽培技術(shù)、植株的保護(hù)、提高經(jīng)濟(jì)效益等產(chǎn)生重要的作用.

本研究通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)和分子實(shí)驗(yàn)，鑒定到2種拮抗真菌，這2種拮抗菌YN12-F和YN12-V能抑制石斛病原真菌赤霉菌和炭疽菌的生長(zhǎng)，其內(nèi)生菌分別屬于黑孢屬[7]和葡萄座腔菌屬[8]真菌.這2種屬的真菌一般認(rèn)為是植物病原真菌，但在本研究中發(fā)現(xiàn)它們屬于石斛內(nèi)生真菌，未引起石斛病害，并能抑制植物病原菌的生長(zhǎng).由于根據(jù)ITS序列分析，只能鑒定到屬，因此，還需在后期通過(guò)分子、形態(tài)等手段對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定.在此基礎(chǔ)上，我們將通過(guò)控制變量法進(jìn)一步探討并優(yōu)化拮抗真菌的培養(yǎng)條件，以達(dá)到對(duì)病原真菌的最佳抑制效果，為解決石斛生長(zhǎng)問(wèn)題提供一個(gè)現(xiàn)實(shí)途徑，也為綠色微生物源農(nóng)藥的研制和植物菌肥的開發(fā)搭建平臺(tái).

[1] 陳曉梅,郭順星.石斛屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2001,13(1):70-75.

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IsolationandIdentificationofAntagonisticFungifromDendrobiumPlants

CAO Mengjie, SHEN Jidong, CHENG Lulu, WANG Huizhong, WU Jianbing

(Colege of Life and Environment Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

The experiment isolated some endophytic fungi from the medicinal Dendrobium plants by plate separation technology, selected the strains with antagonistic activities to pathogenic fungi through plate confrontation test, and then identified the antagonistic fungi by molecular technology. The results show that there are two kinds of antagonistic fungi isolated from mycorrhiza, which belong to Genus Nigrospora and Botryospheria respectively.

Dendrobium; endophytic fungus; antagonistic fungus

2013-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900954)；杭州師范大學(xué)科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(HSQK0080).

吳劍丙(1980—),女，副研究員，博士，主要從事微生物學(xué)研究.E-mail：jianbingwu@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.04.005

Q939.5

A

1674-232X(2013)04-0308-04