梁媛媛,溫漢華,郭衛(wèi)強,焦艷華

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311112)

用于親和分離的鏈霉親和素磁性高分子微球的制備

梁媛媛,溫漢華,郭衛(wèi)強,焦艷華

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311112)

本文使用戊二醛作為偶聯(lián)劑在氨基磁性高分子微球P(St-GMA-NH2)/Fe3O4的表面引入鏈霉親合素(streptavidin，SA)，制備得到鏈霉親和素磁性高分子微球(P(St-GMA-SA)/Fe3O4).使用掃描電鏡(SEM)、紫外光譜(UV)表征了P(St-GMA-SA)/Fe3O4的形貌與結(jié)構(gòu)，探討了反應(yīng)時間，微球用量對微球表面SA引入量的影響，并考察了P(St-GMA-SA)/Fe3O4對生物素化羊抗人抗體(BIgG)的親和吸附能力.結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)時間為12 h，P(St-GMA-NH2)/Fe3O4用量為75 mg時，SA的引入量可達到2.7 μg/mg，P(St-GMA-SA)/Fe3O4在室溫下能快速和BIgG結(jié)合，最大結(jié)合量為7.4 μg/mg，P(St-GMA-SA)/Fe3O4與BIgG形成的復(fù)合物對熱、酸、堿都表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性.

鏈霉親和素；磁性高分子微球；親和分離

0 前 言

鏈霉親和素(streptavidin，SA)是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量65 kD.鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，肽鏈中的色氨酸殘基能和生物素中的活性基團形成特異性結(jié)合.一個鏈霉親和素分子能結(jié)合4個生物素分子，二者的親和常數(shù)可達到2.5×1013(mol/L)-1[1]，且與其他分子非特異性結(jié)合率很低，因此，表面修飾鏈霉親和素的磁性高分子微球可用于捕獲生物素標記的生物分子，包括生物素標記的抗原抗體和核酸、蛋白質(zhì)等，在免疫檢測、DNA分離檢測、細胞分離、蛋白質(zhì)純化等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[2].

本文將以自制的氨基化磁性高分子微球P(St-GMA-NH2)/Fe3O4為原料，戊二醛為偶聯(lián)劑，制備表面修飾鏈霉親合素的磁性高分子微球P(St-GMA-SA)/Fe3O4，對其結(jié)構(gòu)和性能進行表征，并考察其對生物素化羊抗人抗體(BIgG)的親和吸附能力.

1 實驗部分

1.1 試 劑

苯乙烯(St)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純，減壓蒸餾除去阻聚劑后使用)，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)(上海靜超化工有限公司，化學(xué)純，減壓蒸餾除去阻聚劑后使用)，偶氮二異丁腈(AIBN)(上海試四赫維化工有限公司，化學(xué)純，用乙醇重結(jié)晶后使用)，聚乙烯吡咯烷酮(K-30)(天津天泰精細化學(xué)品有限公司)，己二胺(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)，鏈霉親和素(美國NEB公司)，生物素化羊抗人抗體(鼎國生物試劑公司)，油酸鈉，乙醇，氯化鐵，氯化亞鐵，氨水皆為市售品.

1.2 鏈霉親和素修飾的磁性高分子微球的制備

(1) P(St-GMA-NH2)/Fe3O4的制備.在5 g自制凍干的P(St-GMA)/Fe3O4磁性微球[3]中加入50 mL水和50 mL己二胺，超聲10 min混合均勻后轉(zhuǎn)移到250 mL三頸瓶中，機械攪拌，在80 ℃時反應(yīng)12 h.將反應(yīng)后的混合液進行磁分離后，用純水洗滌多次除去多余乙二胺，凍干得到棕黃色的粉末，即P(St-GMA-NH2)/Fe3O磁性微球.

(2) SA溶液的配置.用純水配制磷酸鹽(PB)緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.0)，進行高壓滅菌，將1 mg的SA溶于1 mL的PB溶液中，取200 μL裝于EP管中待用.

(3) P(St-GMA-NH2)/Fe3O4分散液的配置.將50 mg P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球放入滅菌水中浸泡，用PB緩沖液清洗3次后，再加入2.5 mL PB，超聲分散10 min后待用.

(4) SA在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的偶聯(lián).取2.5 mL P(St-GMA-NH2)/Fe3O4分散液，加入2 mL的戊二醛室溫震蕩反應(yīng)6 h，進行磁分離，多次用大量純水清洗多余的戊二醛后，將磁性微球重新懸浮在2.5 mL PB緩沖液中，然后再加入到裝有200 μL的上述鏈霉親和素溶液的EP管中，室溫震蕩培養(yǎng)6 h.最后將P(St-GMA-SA)/Fe3O4分散在5 mL PB緩沖液中(濃度為10 mg/mL)，4 ℃保存待用.

1.3 P(St-GMA-SA) /Fe3O4形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微球的形貌，應(yīng)用 SEM 照片分析微球的平均粒徑E(D).按式1計算微球的平均粒徑，其中，di表示微球的粒徑，ni表示粒徑為di時的微球個數(shù).

(1)

1.4 鏈霉親合素含量測定

(1) 配制不同濃度的鏈霉親和素標準溶液，用紫外分光光度計測定其在280 nm處的吸光度值，繪制濃度-吸光度標準曲線，如圖1所示.

圖1 鏈霉親合素的濃度-吸光度標準曲線Fig. 1 Standard curve of SA solution

(2) 將一定質(zhì)量的P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球分別放入EP管A中，加入滅菌水浸泡，用PB緩沖液清洗3次，加入2.5 mLPB超聲混均后加入2 mL的戊二醛室溫震蕩6 h，進行磁分離，然后多次用大量水清洗多余的戊二醛.再用PB緩沖液洗滌二次，磁分離除去上清液.將1 mg的SA溶于1 mL的PB溶液中，分別取200 μL裝入EP管B中，加入2.5 mL PB溶液，混合均勻，用紫外分光光度計測定其在在280 nm處的吸光度值，計為a.將上述SA溶液加入到EP管A中，室溫震蕩反應(yīng)6 h，磁分離取上清，測定其280 nm處吸光度值，計為b.則P(St-GMA-NH2)/Fe3O4中SA的含量用式2計算.

(2)

式中：ω: P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球SA含量(μg/mg);

V: 溶液的體積(mL);

m: P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球的質(zhì)量(mg).

1.5 P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG吸附量的測定

(1) 配制不同濃度的BIgG標準溶液，用紫外分光光度計測定其在275 nm處的吸光度，繪制其濃度-吸光度標準曲線，如圖2所示.

圖2 BIgG的濃度-吸光度標準曲線圖Fig. 2 Standard curve of BIgG solution

(2) 分別取1、2、3、4、5 mL自制的P(St-GMA-SA)/Fe3O4，裝入5個EP管中(編號為1-5)，磁分離除凈上清液.把200 μL一定濃度的BIgG裝在5個EP管中，加入2 mL PB溶液，混合均勻，用紫外分光光度計測定其在在275 nm處的吸光度，計為a；然后把它們分別加入到1-5號EP管中，室溫培養(yǎng)0.5 h，磁分離取上清液，測定其275 nm處吸光度，計為b.則P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的吸附量用式3計算.

(3)

式中：ω: P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球BIgG的吸附量 (μg/mg )；V：溶液的體積 (mL)；m：P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球的質(zhì)量 (mg).

2 結(jié)果與討論

2.1 SA在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的引入

使用戊二醛作為偶聯(lián)劑，利用其醛基和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球表面的氨基以及鏈霉親合素的氨基之間發(fā)生的親核加成反應(yīng)，在磁性微球表面引入鏈霉親合素，制備鏈酶親和素磁性高分子微球P(St-GMA-SA)/Fe3O4.反應(yīng)示意圖如圖3所示.

圖3 P(St-GMA-NH2)/Fe3O4 表面修飾鏈霉親合素示意圖Fig. 3 Illustration of preparation of P(St-GMA-SA) /Fe3O4

圖4是 P(St-GMA -NH2)/Fe3O4和P(St-GMA-SA) /Fe3O4的SEM照片，從圖中可以看出修飾前后的磁性微球粒徑和形貌未發(fā)生明顯變化，說明通過戊二醛偶聯(lián)反應(yīng)在磁性微球表面引入鏈霉親和素，對微球的形貌不會產(chǎn)生破壞，可滿足后續(xù)實驗要求.從SEM照片中選取100個微球進行統(tǒng)計分析，按式1計算可知P(St-GMA-SA) /Fe3O4平均粒徑為2.2μm.

圖4 P(St-GMA-NH2)/Fe3O4(a)和P(St-GMA-SA)/Fe3O4(b)的SEM照片F(xiàn)ig. 4 The SEM photographs of P(St-GMA-NH2)/Fe3O4(a) and P(St-GMA-SA)/Fe3O4(b)

圖5 反應(yīng)前(a)后(b)溶液的紫外吸收圖譜Fig. 5 Changes of UV-Vis(a,b) spectra before and after SA entrapment

由于SA在波長280 nm處存在紫外吸收，故可以通過檢測反應(yīng)前后溶液在該處波長的吸光度值變化確定SA是否在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面引入以及引入量，反應(yīng)后殘液的吸光度值越低，說明SA在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的引入量越高.反應(yīng)前后的溶液紫外光譜如圖5所示.從圖中可以看出，反應(yīng)后溶液在280 nm處的紫外吸收峰強度下降，說明溶液中游離的SA濃度下降，即部分SA引入到了P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面，按式2可計算得到P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的SA的引入量為2.7 μg/mg.

反應(yīng)結(jié)束后，去除上層殘液后，再加入等量PB，震蕩12 h后上清液的吸光度基本不變，說明SA通過戊二醛偶聯(lián)作用共價連接于P(St-GMA-NH2)/Fe3O4，而不是以物理吸附方式作用于微球表面[4].

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)時間

考察反應(yīng)時間對SA在P(St-GMA-SA)/Fe3O4表面引入量的影響，將P(St-GMA-NH2)/Fe3O4與戊二醛的反應(yīng)時間計為t1，進一步偶聯(lián)SA的反應(yīng)時間計為t2，實驗結(jié)果如表1所示.從表1中可看出，當(dāng)t2保持2 h不變，適當(dāng)延長t1，SA的引入量有所增加，但延至6 h后不再增加.保持t1為6 h，隨著t2的增加，SA的引入量增加，當(dāng)t2等于6 h時，再延長反應(yīng)時間，殘液的吸光度值基本保持不變，說明SA已和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4反應(yīng)完全.故t1和t2均為6 h時，可獲得具有最大SA修飾量P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球.

2.3.2 磁性微球用量

圖6是不同用量的P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球?qū)A引入量的的影響.從中可看出，隨著微球用量增加，SA的引入量增加，當(dāng)微球用量為75 mg時，SA在微球表面的引入量已到達飽和，P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面SA的最大修飾量為2.7 μg/mg.

表1 SA引入量和反應(yīng)時間的關(guān)系

t1——P(St-GMA-NH2)/Fe3O4和戊二醛的反應(yīng)時間;

t2——進一步偶聯(lián)SA的時間;

a——反應(yīng)前SA溶液的吸光度值;

圖6 SA引入量和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4用量的關(guān)系Fig. 6 Effect of quantity of the P(St-GMA-NH2)/Fe3O4 on the SA entrapment

b——反應(yīng)后上層殘液的吸光度值.

2.3.3 P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG吸附作用

圖7 P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的吸附量與時間的關(guān)系Fig. 7 Effect of contact time on BIgG adsorption on the P(St-GMA-SA)/Fe3O4

鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，肽鏈中的色氨酸殘基能和生物素中的活性基團形成特異性結(jié)合，為了考察P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG有特異親和作用能力，考察了P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的結(jié)合量與時間的關(guān)系，結(jié)果如圖7所示.從圖7中可看出，在30 min內(nèi)，P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG結(jié)合量可達到7.4 μg/mg，再延長反應(yīng)時間，結(jié)合量無明顯變化.說明P(St-GMA-SA ) /Fe3O4微球能在較短時間內(nèi)捕獲溶液中游離的BIgG，其吸附容量與市售的Dynabeads? M-280磁珠相當(dāng).

為了考察P(St-GMA-SA)/Fe3O4與BIgG形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，將其分別進行如下處理：

(1) 加入PBS，在50 ℃震蕩6 h.

(2) 加入HCl，調(diào)節(jié)pH值為1.0，震蕩6 h.

(3) 加入NaOH，調(diào)節(jié)pH值為13.0，震蕩6 h.

磁分離除去復(fù)合物，檢測上層清液的紫外吸光度值，均未發(fā)生明顯變化，說明P(St-GMA-SA)/Fe3O4與BIgG形成復(fù)合物未發(fā)生解離，對熱、酸、堿均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，也進一步說明了BIgG是通過與微球表面的鏈霉親和素特異親和作用而固定于微球表面，而不是通過非特異的物理吸附作用與磁性微球結(jié)合.

3 結(jié) 論

(1) 用戊二醛作交聯(lián)劑，在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面引入鏈霉親合素，微球平均粒徑為2.2 μm，粒徑分布均勻.

(2) 考察了反應(yīng)時間和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4磁性微球用量對SA引入量的影響，當(dāng)P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球偶聯(lián)戊二醛，再偶聯(lián)鏈霉親合素的反應(yīng)時間均為6 h，磁性微球用量為75 mg時，SA引入量可達到2.7 μg/mg.

(3) 考察了P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的親和結(jié)合能力，結(jié)果表明(St-GMA-SA)/Fe3O4能快速與BIgG結(jié)合，0.5 h內(nèi)即可反應(yīng)完全，BIgG最大結(jié)合量為7.4 μg/mg，所形成的P(St-GMA-SA)/Fe3O4-BIgG復(fù)合物對熱、酸、堿都表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性.

[1] Green N M. Avidin and strptavidin[J]. Methods Enzymol, 1990,184(3):51-67.

[2] 沈關(guān)心，周汝麟. 現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)[M]．武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002：223.

[3] 溫漢華，梁媛媛，黃志堅，等.分散聚合法制備含環(huán)氧基團的磁性高分子微球[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，10(2)：141-144.

[4] Savage D, Mattson G, Desai S,etal. Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook[M]. Rockford: Pierce Chemical Co,1992:79.

PreparationofStreptavidinMagenticPolymerMicrospherefortheAffinitySeparation

LIANG Yuanyuan, WEN Hanhua, GUO Weiqiang, JIAO Yanhua

(Research Centre of Biomedicine and Health, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, China)

Streptavidin magnetic polymer microsphere P(St-GMA-SA)/Fe3O4was prepared by introducing bimolecular streptavidin (SA) into the surface of P(St-GMA-NH2)/Fe3O4with the aid of glutaraldehyde as crosslinking agent. The paper characterized the appearance and structure of P(St-GMA-SA)/Fe3O4by SEM and UV, discussed the influences of reaction time and microsphere amount on the intake of SA, and investigated the affinity adsorption ability of P(St-GMA-SA)/Fe3O4to BIgG.The results show that the intake of can reach to 2.7 μg/mg in 12 hours when the (St-GMA-NH2)/Fe3O4dosage is 75 mg. P(St-GMA-SA)/Fe3O4is able to combine with BIgG to form stable complexes under mild conditions, which are stabile to heat, acid and alkali, and the maximum BIgG binding capacity is 7.4 μg/mg.

streptavidin; magnetic polymer microsphere; affinity separation

2012-11-20

浙江省公益計劃項目(2010C33132)；杭州科技計劃發(fā)展項目(20101133N04)；杭州師范大學(xué)科研啟動項目(PD10002004001040).

梁媛媛(1980—),女，助理研究員，博士，主要從事多功能納米復(fù)合材料研究.E-mail:liangyy@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.02.012

TB34

A

1674-232X(2013)02-0145-05