盛寶英 田嘉瑩 田國忠 齊志國 熊慶華

·論著·

四乙胺對Aβl-40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞的存活及其Caspase-3表達(dá)的影響

盛寶英 田嘉瑩 田國忠 齊志國 熊慶華

目的探討鉀通道阻滯劑四乙胺(tetraethy-lammonium， TEA)在Aβl-40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞增殖及凋亡中的作用。方法Aβl-40與神經(jīng)干細(xì)胞共孵育，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞損傷，以 TEA作用于Aβl-40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞,利用MTT 法和比色法分別檢測神經(jīng)干細(xì)胞在不同的時間點的存活率及Caspase-3活性。結(jié)果Aβl-40可使神經(jīng)干細(xì)胞的存活率降低，呈時間依賴性； Aβl-40與神經(jīng)干細(xì)胞在不同的時間點共孵育后，Caspase-3活性逐漸增加，在24 h達(dá)到高峰；加入TEA后，Aβl-40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞的存活率增加，Caspase-3活性表達(dá)下降。結(jié)論Aβl-40對神經(jīng)干細(xì)胞的致傷作用可能與鉀通道的激活相關(guān)，TEA能夠降低Aβl-40對神經(jīng)干細(xì)胞的致傷作用，減少神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡為治療阿爾茨海默病提供了新的方法。

阿爾茨海默病；四乙胺;β-淀粉樣多肽；神經(jīng)干細(xì)胞

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是與衰老相關(guān), 以嚴(yán)重的高級認(rèn)知功能障礙為特征的隱襲性、逐漸性進展的退行性腦病[1,2]。AD 發(fā)病機制極其復(fù)雜, 主要病理學(xué)特點是β-淀粉樣多肽(Aβ)聚集形成的老年斑(SP) 和神經(jīng)原纖維纏結(jié) (NFT) 的形成, 伴腦皮質(zhì)層神經(jīng)元減少[3,4]。在研究中發(fā)現(xiàn)，AD患者常伴發(fā)大腦海馬區(qū)的萎縮和神經(jīng)干細(xì)胞的減少。同時也證實Aβ具有神經(jīng)元毒性作用[5]和誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡[6]，Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的同時均伴隨鉀通道激活，尤其是延遲整流鉀電流增強[7]。TEA是鉀通道阻滯劑，研究證實心肌細(xì)胞凋亡中鉀通道阻滯劑能起到保護和抑制的作用[8]。本研究以鉀離子通道阻滯劑TEA作用于Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞，觀察神經(jīng)干細(xì)胞存活和Caspase-3活性的變化，探討Aβ致傷的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡時鉀通道阻滯劑TEA在其中的作用。

1 資料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器 雄性 Wistar 大鼠(<24 h)，由佳木斯大學(xué)動物中心提供；DMEM/F12(Gibco); 四乙胺(tetraethylammonium,TEA)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、多聚賴氨酸 (Sigma公司)；胎牛血清(北京中杉金橋公司)；酶標(biāo)計數(shù)儀ELX800(Bio-TEK公司)；Aβ1-40(Biosouxee公司)；Caspase分析試劑盒(美國Promega公司)。Nestin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；IBE2003倒置熒光顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

1.2大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的分離與傳代培養(yǎng)及鑒定 新生的Wistar 大鼠(<24 h)，無菌操作打開顱腔并取海馬組織，用Hank’s液進行漂洗，將組織剪成1 mm3左右的小塊加入培養(yǎng)液(DMEM/F12 1 ∶ 1，2%B27，bFGF 20 μg/L，表皮生長因子20 μg/L)5 ml，細(xì)滴管輕輕吹打后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整一定濃度后接種于培養(yǎng)瓶中，將其放入5%CO2培養(yǎng)箱中，每3 d換半量培養(yǎng)液一次，每7 d傳代一次，方法同上。取傳代培養(yǎng)的神經(jīng)球涂布在0.01%多聚賴氨酸的無菌蓋玻片上，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，用0.01 mPBS漂洗，吹干后行Nestin細(xì)胞免疫化學(xué)檢測。

1.3實驗分組 實驗共分四組：Aβ1-40組：在傳三代后的神經(jīng)干細(xì)胞加入Aβ1-405 μM；Aβ1-40+TEA組：在Aβ1-405 μM孵育前30 min加入TEA 5 mM；空白對照組：加入等量的培養(yǎng)液的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)組；TEA對照組：神經(jīng)干細(xì)胞加入TEA 5 mM。上述各組分別在0 h，12 h，24 h和48 h個時間點行細(xì)胞活性及凋亡檢測。

1.4MTT法檢測神經(jīng)干細(xì)胞的存活率 四組傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)不同處理后，停止培養(yǎng)前4 h將每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl使終濃度為 1 mg/ml，放置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用翻板法將96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基棄去，在每孔中加入溶解液 DMSO 150 μl，振蕩 10 min使其充分溶解結(jié)晶產(chǎn)物。在酶標(biāo)儀上以波長570nm檢測每孔的OD值。所檢測OD值的大小可反映細(xì)胞代謝活性的強弱。每組設(shè)3個孔，實驗重復(fù)3次，細(xì)胞存活率的計算：細(xì)胞存活率=試驗組光吸收值/對照組光吸收值×100%。

1.5比色法檢測神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3的表達(dá) 將不同處理組的神經(jīng)干細(xì)胞，用PBS在細(xì)胞表面漂洗兩次，然后收集到EPPendoff管內(nèi)，450×g，4℃離心10 min收集細(xì)胞。放于冰上，用冰冷的PBS漂洗一次，然后懸浮在100 μl細(xì)胞裂解緩沖液中。以液氮-常溫的方式裂解細(xì)胞，然后在冰上孵育 15 min。15，000×,4℃離心 20 min后收集上清液。用Bradford方法測蛋白的濃度。按試劑盒依次在96孔板內(nèi)依次加樣。加2 μl DEVD-pNA底物(10 mM)到96孔板內(nèi)。用parafilm封口膜將板子封嚴(yán)，37℃孵育4 h。在405nm測量吸光度。計算Caspase-3特異性活性。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及Nestin抗原表達(dá) 新生大鼠海馬區(qū)新鮮分離的單個神經(jīng)干細(xì)胞呈透亮的圓形(見圖1),傳代培養(yǎng)至第三代可見培養(yǎng)液中形成較大的神經(jīng)球(見圖2)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記性蛋白Nestin傳代培養(yǎng)神經(jīng)球的表達(dá)(見圖3)。

2.2TEA對Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響 加入Aβ1-40后，神經(jīng)干細(xì)胞在不同的時間點，細(xì)胞存活明顯減少(P<0.05)，且隨時間延長，細(xì)胞存活減少的愈加明顯。Aβ1-40+TEA組較Aβ1-40組細(xì)胞存活明顯增加(P<0.05)，而空白對照組和TEA對照組神經(jīng)干細(xì)胞存活無明顯改變(P>0.05)，且細(xì)胞數(shù)明顯增加。鏡下可見細(xì)胞形態(tài)無明顯示變化。(見表1)

圖1 新鮮分離的NSCs(×100)

圖2 傳至第三代的NSCs(×200)

圖3 NSCs呈Nestin陽性

2.3TEA對Aβ1-40誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞caspase-3活性的變化 Aβ1-40分別孵育后上述各時間點, Caspase-3活性逐漸增加(P<0.05),在24 h達(dá)到高峰(P<0.01)。與Aβ1-40+TEA組在各時間點均可降低Caspase-3的表達(dá)(P<0.05)，特別在24 h這種趨勢更為明顯(P<0.01)，而空白對照組和TEA對照組在0 h,12 h,24 h和48 hCaspase-3特異性活性未發(fā)生明顯改變(見表2)

表1 不同培養(yǎng)時間各組神經(jīng)干細(xì)胞存活率的變化

注：1.Aβ1-40組與空白對照組相比,aP<0.05;2.Aβ1-40+TEA組與Aβ1-40處理組相比，bP<0.05;

表2 不同時間點各組神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3活性的變化

注：Aβ1-40組與空白對照相比，aP<0.05；12 h Aβ1-40組與24 hAβ1-40組相比,bP<0.01；48 h Aβ1-40組與24 h Aβ1-40組相比,cP<0.01；Aβ1-40+TEA組與Aβ1-40組相比,dP<0.05；24 hAβ1-40組與24 hAβ1-40+TEA組相比，eP<0.01

3 討論

正常腦組織中在室管膜下區(qū)、海馬和脈絡(luò)膜叢存在大量的神經(jīng)干細(xì)胞，這些細(xì)胞增生活躍，特別在缺血缺氧情況下，可刺激這些區(qū)域神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移并分化。研究表明，AD患者的上述各區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且分化不良。其具體的致病原因還不十分清楚。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1-40致傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖減速，且凋亡增加，可能是導(dǎo)致其中的致病機體發(fā)病原因之一。以往研究表明AD患者神經(jīng)元減少，凋亡明顯[9]。在本實驗中可見與Aβ1-40共同培養(yǎng)后，神經(jīng)干細(xì)胞的存活減少，凋亡增加，這也可能是AD患者神經(jīng)干細(xì)胞無法分化成為神經(jīng)元，而導(dǎo)致神經(jīng)元缺失增多的原因。

凋亡，是能量依賴細(xì)胞內(nèi)程序性死亡。在通常情況下，組織細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞更新，進而保持組織細(xì)胞的動態(tài)平衡中，凋亡起到相當(dāng)重要的作用。但是在一些化學(xué)、物理、環(huán)境或遺傳學(xué)等方面的損傷因素作用下可介導(dǎo)病理性自主性有序性的細(xì)胞死亡[10]。

凋亡不僅由基因調(diào)控，凋亡的啟動有多種機制，特別是細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)尤其是K+的穩(wěn)態(tài)調(diào)控在凋亡中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，將神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入一定濃度的Aβ1-40后，神經(jīng)元細(xì)胞膜鉀通道被異常激活，同樣膽堿能干細(xì)胞株SN56神經(jīng)元與Aβ共培養(yǎng)也得到相同的結(jié)果，TEA抑制Aβ1-40毒性68%以上[11]。本研究發(fā)現(xiàn)將鉀通道阻滯劑TEA加入Aβ1-40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞后，可將神經(jīng)干細(xì)胞的存活率增加，而凋亡率下降。這說明鉀通道在Aβ1-40致傷神經(jīng)干細(xì)胞，調(diào)控凋亡中起到一定的作用。在對AD患者中的研究也同樣發(fā)現(xiàn)，延遲整流鉀通道異常激活，電流密度增加，神經(jīng)元存活減少，鉀通道阻滯劑TEA阻斷此通道或者高K+均可抑制外向電流，延長動作電位時程，升高細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]濃度，從而抑制神經(jīng)元的Aβ1-40毒性[12]。該結(jié)果與本實驗的神經(jīng)干細(xì)胞被Aβ1-40致傷后TEA發(fā)揮的作用基本相似。

凋亡信號起動Caspase-3活化[13]，活化的Caspase-3作用于底物蛋白，促進底物分解，引起凋亡[14]。因此,通過 檢測Caspase-3 的活性大小即可了解細(xì)胞凋亡的變化。本實驗中，Aβ1-40致傷神經(jīng)干細(xì)胞后，Caspase-3活性增加，且其活性與時間呈正比，當(dāng)達(dá)到一定時間后這種比例關(guān)系破壞，即Caspase-3活性不會因時間延長而增加，而是保持相當(dāng)?shù)幕钚运健＿@種作用在被TEA所阻斷，外源性鉀離子通道阻滯劑TEA能夠降低Aβl-40對神經(jīng)干細(xì)胞的致傷作用，減少神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。雖然神經(jīng)干細(xì)胞Aβ1-40致傷后鉀通道通過什么途徑激活神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，其機制還不是十分清楚，但神經(jīng)干細(xì)胞鉀通道阻滯劑TEA在AD患者中的變化對研究AD的發(fā)病機制和藥物干預(yù)提供新的思路。

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Theeffectsoftetraethyl-lammoniumtothesurvivalandCaspase-3expressionofAβl-40-inducedneuralstemcells

SHENGBao-ying，TIANJia-ying，TIANGuo-zhong，etal.

ObjectiveUsing tetraethyl-lammonium (TEA), this acts as a potassium channel blocker, to interfere the Aβl-40-injured neural stem cells (Aβl-40-NSCS),and observing the survival and Caspase-3 expression of Aβl-40-NSCS, we wants to know the effects of potassium channels blocker TEA in the proliferation and apoptosis of Aβl-40-NSCS.MethodsWe incubated neural stem cells with Aβl-40(TEA), which were known as the Aβl-40-injured neural stem cells (Aβl-40-NSCS). Then the Aβl-40-NSCS were dealt with TEA. We measured the survival and Caspase-3 activity of Aβl-40-NSCS at different time points by MTT and colorimetric methods.ResultsA certain concentration of Aβl-40can reduce the survival of NSCS, which was time dependent. The Caspase-3 activity of the Aβl-40-NSCS gradually increased and reached the peak at 24 h Caspase-3 activity. Treated with TEA, the survival rates of the Aβl-40-NSCS increased and the expression of Caspase-3 activity decreased.ConclusionAβl-40 can induce the injury of NSCS, resulting in decreased proliferation, survival and increased apoptosis of NSCS. The TEA, which acts as a potassium channel blocker, can reduce the injury effects of Aβl-40to NSCS and apoptosis of NSCS. Therefore, the injury effects of Aβl-40to NSCS may be related with the activation of pstassium ion channels, and the TEA may be a new molecule target of Alzheimer’s disease.

Alzheimer’s disease; Tetraethy-lammonium; Aβ; Neural Stem Cells(NSCs)

黑龍江省佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目資金(項目編號：YJSCX2011-021JD)；黑龍江省科學(xué)技術(shù)研究項目(項目編號：2012772)

154000 佳木斯大學(xué)