李巧云 聞立紅 顏秋梅

KLK14在宮頸癌組織中的表達及其意義

李巧云 聞立紅 顏秋梅

目的探討KLK14蛋白宮頸癌中的表達及與臨床病理關系。方法應用免疫組織化學法SP檢測10例正常宮頸14例慢性宮頸炎48宮頸癌組織中KLK14蛋白的表達。應用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應法RT-PCR檢測25例宮頸鱗癌及10例正常宮頸組織中KLK14 mRNA的表達。結果KLK14蛋白在48例宮頸癌中陽性率72.9%，正常宮頸20%，慢性宮頸炎14.3%,三者相比差異有統(tǒng)計學意義，KLK14蛋白陽性率與腫瘤臨床分期，病理學相關(P<0.05),與年齡組織學分級淋巴轉移無關(P>0.05)。KLK14 mRNA在宮頸癌相對表達量高于正常宮頸組織。結論KLK14表達參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

宮頸鱗癌；人激肽釋放酶14；逆轉錄聚合酶鏈反應

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，療效總體生存率不高，經(jīng)常地進行評估是必須的，激肽釋放酶(kallikrein，KLK)家族是目前被研究與惡性腫瘤表達相關的基因家族， 參與體內多種生理病理過程。KLK14是KLK家族中一員，擬采用SP及RT-PCR研究宮頸癌細胞內KLK14蛋白及mRNA的表達，探討其在宮頸癌中發(fā)生發(fā)展意義及與臨床病理的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 48例宮頸癌取自2007年1月至2010年1月我院手術切除標本，正常宮頸10例，慢性宮頸炎14例來源于同期子宮切除術標本，所有標本部分存于-80℃冰箱中用RNA提取，另一部分用福爾馬林固定石蠟包埋進行SP檢測?；颊吣挲g29～71歲，中位年齡43.5歲。宮頸癌病理：鱗狀細胞癌43例，腺癌5例，分期：I 期21例,Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，IV期5例。分級：G112例，G220例，G316例。淋巴轉移者17例，無淋巴轉移者31例。所有患者均為初發(fā)者，術前均未接受過放化療治療。同期取正常宮頸組織10例和25例宮頸鱗癌行RT-PCR實驗。

1.2主要試劑山羊抗人KLK14多克隆抗體(Santn Cruz公司)和SP-9003三步法試劑盒(兔抗羊，北京中杉公司).Trizol試劑購自invitrogen公司，AMV逆轉錄試劑盒(AMV3500)購自promega公司。Ex-Taq酶試劑盒購自大連寶生物公司。KLK14及β-actin引物由上海生工生物有限公司合成。RT-PCR儀器為bio-rid公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1SP法 所有組織標本固定石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，每批染色均設陰性和陽性對照。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS) 代替一抗，陽性對照取已知KLK蛋白表達陽性的乳腺癌組織的石蠟切片。

1.3.2RT-PCR法 采用Trizol一步法提取組織總RNA，取1 μg總RNA，用AMV逆轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA(逆轉錄反應參照試劑盒說明進行)，取2 μg cDNA為模板進行PCR反應，KLK14上游引物序列為5’-CCGCAGACTTCACCACTCG TAT-3’，下游引物序列為5’-AGGTGTGAGGCAGGCGIAAF-3’，用β-actin作為內參照，上游引物為5’-TGGCAGGACTTCA GA-3’，下游引物5’-AGTGGCTAGAAGTTCACC-3,[1]。PCR反應條件為：95℃預變性4 min, 95℃變性30 sec,56℃退火30 sec,72℃延伸30 sec，35個循環(huán)后最后72℃延伸5 min,所有的反應體系均做2管，作為平行對照。在實驗過程中，每次結束均將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產(chǎn)物長度。紫外分光光度計檢測RNA純度及濃度。

1.4陽性結果判定標準免疫組織化學 參照文獻[2]制訂。KLK14蛋白定位細胞漿，顯示胞漿為淡黃色或棕黃色者為陽性細胞，凡顯色強度與背景無明顯差異者為陰性，而顯色強度高于背景為陽性表達，將陽性細胞按其數(shù)量及顯色強度分為3級，表達陽性細胞數(shù)小于10%，染色強度為弱陽性或僅個別細胞呈中至強陽性染色，即為表達弱陽性(+)；陽性細胞為60%以上，多數(shù)細胞呈黃色或棕黃色染色，即表達強陽性+++；表達的陽性細胞數(shù)及強度介于上述二者之間為陽性(++)。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件。各計量資料比較應用t檢驗(經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗)，KLK14表達與臨床參數(shù)關系采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1sP染色顯示KLK14蛋白定位于宮頸上皮細胞漿，陽性表達率簡表1，三者相比差異有統(tǒng)計學意義

2.2KLK14蛋白表達與宮頸癌病理的關系(見表2)KLK14蛋白的表達與臨床分期、病理學有關，與年齡、組織學分級和淋巴結轉移無。

圖1 宮頸鱗狀細胞癌KLK14蛋白++陽性表達(×200)

組織類型例數(shù)KLK14-+χ2值P值正常108(80)2(20)*炎癥1412(85.7)2(14.3)*惡性4813(27.1)35(72.9)20.4680.001

表2 KLK14蛋白與宮頸癌臨床病理因素間的關系(*表示校正卡方檢驗)

2.3KLK14 mRNA在不同宮頸組織中的表達 RT-PCR產(chǎn)物KLK14及β-actin PCR產(chǎn)物片斷長度為624 bp，455bp。10例正常宮頸組織KLKmRNA表達產(chǎn)物的相對表達量為0.30～0.95之間，25宮頸鱗癌 的在為0.88～1.81之間，KLK14 mRNA在宮頸鱗癌組織中的表達顯著高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-8.582,P<0.01)。

2.4KLK14蛋白與KLK14 mRNA表達的相關性 宮頸鱗癌中KLK14 mRNA的基因表達率很高，與正常宮頸組織表達量之間的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，這說明KLK14 mRNA水平和蛋白水平表達有一致性。

圖2 KLK14 mRNA在宮頸正常組織和宮頸癌組織中的表達

1.DNA分子量標準；2.2,3正常宮頸組織,3.4,5，6：宮頸鱗癌

3 討論

3.1KLK基因家族及KLK14的結構特點及蛋白生物學功能 目前發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)展是一個多級式過程，腫瘤細胞是從基本位點脫落通過血液運輸播散至遠處器官產(chǎn)生腫瘤轉移。臨床試驗表明惡性腫瘤細胞的發(fā)生依賴惡性腫瘤細胞合成分泌的蛋白水解酶穿透細胞基底膜侵襲鄰近組織，現(xiàn)和腫瘤進展密切相關的胞外蛋白酶有基質金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶[3]。人激肽釋放酶KLK(kallikrein)是一組大的絲氨酸蛋白酶家族，位于19q13.4染色體上，由15個成員組成， 通過激肽釋放，降解胰島素原LDL,血管緊張素，精原素等生物學功能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤侵潤轉移等。

KLK14是KLK家族中一員，全長6439bp，有三聯(lián)體殘基表明KLK14具有胰蛋白酶活性，翻譯分泌性蛋白[4]。 KLK14基因及蛋白與婦科腫瘤，消化道腫瘤，乳腺癌，肺癌等疾病發(fā)生發(fā)展有重要關系[4]。

3.2KLK14基因及蛋白在不同宮頸組織的表達意義 本實驗研究了KLK14蛋白在宮頸細胞中表達，發(fā)現(xiàn) KLK14在正常宮頸，宮頸炎性上皮細胞內表達率較低，在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達，與KLK14蛋白在卵巢癌，KLK7、KLK8在宮頸癌中高表達一致[5]，通過對KLK14蛋白與宮頸癌臨床病理特征分析，發(fā)現(xiàn)KLK14蛋白的表達與宮頸癌的年齡及組織學分級無關，與臨床分期，病理類型相關，Ⅲ/Ⅳ期患者陽性率高于Ⅰ/Ⅱ期，表明KLK14蛋白的表達一定程度上與宮頸癌的臨床進展相關，本組研究也發(fā)現(xiàn)KLK14 mRNA在宮頸癌中高表達，與正常宮頸組織表達量之間的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，這說明KLK14 MRNA水平和蛋白水平表達有一致性。由此推測KLK14可能與宮頸癌潛在生物學行為密切相關，可能會是一個有價值的腫瘤標記物。但因樣本量偏小，KLK14與宮頸癌的淋巴轉移之間的關系還有待進一步研究。

[1] Yousef GM, Diamandis EP. The new human tissue kallikrein gene family:seucture, function, and associationto disease. Endo Rev,2001,22:184-204.

[2] ZucolloA, Dziubecki D, Villareal. et al. The development of insulitis and the kallikrein-kimn system. Int Immunophyarmacol, 2002, 2:1941-1947.

[3] Yourself GM, DiamandisEP. An overview of the kallikrein gene families in human and other species emerging candidate eumomarkers. Clin Biocken, 2003, 36(6):443.

[4] AlessandroD Aanti, Stefania Cane,Stefania Bellone.et al.The serine protease stratum corneum chymotryptic enzyme(kallikrein7)is lighly overexpressed in squmous cervical cancer cells.Cynecol Oncol,2004,94(2):283-8.

[5] Canes, BignottiE, BelloneS. et al. The novel serine protease tumor-associated differentially expressed gene-14(klk8/Neuropsin/Ovasin)is highly over expressed in ervical cancer. AMJ Obstet Gynecol,2004,190(1):60-66.

ExpressionofKLK14proteinincervicalcance

LIQiao-yun,WENLi-hong,YANQiu-mei.

DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity450052

ObjectiveTo analyse the expression of klk14 in cervical cancer and the results were studied in correlation with clincopa thological characteristics of patients.MethodsThe expression of KLK14 protein was analysed by immunohistochemistry in paraffin embedded 48 cervical carcinomas, 14 chronic cervicitis and 10 normal cervical tissues. The expression of KLK14 mRNA was determined by RT-PCR in 25 cases of cervical squamous carcinomas and 10 cases of normal cervical tissues.ResultsThe expression of KLK14 protein was observed in cervix tissue, chronic cervicitis and cervical cancer, respectively 20%, 14.3% and 72.9%, there was a stastistical significance. The positive expession of the KLK14 protein was significantly related to clinical stage, pathological type (P<0.05), and not related to age,histological grade,lymph node metastasis. (P>0.05) The mRNA expression of KLK14 in squamous carcinomas are more higher in cervical normal tissues.ConclusionThe expression of KLK14 protein was related to the occurrence and development of cervical squamous carcinomas

Cervical squamous carcinomas； KLK14 protein； RT-PCR

河南省衛(wèi)生廳課題項目(項目編號：2008046)

450052 鄭州大學第五附屬醫(yī)院