田倩倩，宋 萍，陳 晨，林 明，江 凌，李 霜

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009)

乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase，縮寫AXE)是一類可以將木聚糖或低聚木糖中?；倪拎咎侨ヵ；⑨尫懦龃姿岬孽ッ福诸愑隰人狨ッ讣易澧?，可以水解短鏈脂肪酸及各種?；衔?，具有廣泛的底物特異性［1］。乙酰木聚糖酯酶在半纖維素木聚糖的降解中起著重要作用［2］;并且具有良好的?；ッ富钚?，可以催化7-氨基頭孢烷酸和頭孢菌素C脫?；铣搔?內(nèi)酰胺類抗生素母核，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值［3］。

乙酰木聚糖酯酶產(chǎn)生菌種多為真菌，主要有Volvariella volvacea［4］、Trichoderma［5］，Aspergillus［6］，Penicillium［7］、 Schizophyllum［8］、 Rhodotorula［9］、Fusarium［10］和 Streptomyces［11］;細菌產(chǎn)生菌種主要為Bacillus［12］、 Thermobifida［13］、 Firobacter［14］和Thermoanaerobacterium［15］等。相對于真菌，細菌乙酰木聚糖酯酶種類相對較少，且酯酶活力較低［16］。

以一種高活力枯草芽胞桿菌乙酰木聚糖酯酶為研究對象，發(fā)現(xiàn)其相對分子質(zhì)量不同于已報道的芽胞菌屬乙酰木聚糖酯酶，并具有較短的發(fā)酵時間。因此考察誘導(dǎo)劑對乙酰木聚糖酯酶的影響，以期選擇一種新的乙酰木聚糖酯酶活導(dǎo)劑來提高酶活力。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽胞桿菌CICC 20034(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)。對硝基苯酚乙酸酯、燕麥木聚糖、木糖等購自Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L):蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):M9CA培養(yǎng)基，誘導(dǎo)劑添加量 0.5%［12］。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

自斜面取1環(huán)菌接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)6 h。以0.5%的接種量接入250 mL裝50 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃、200 r/min發(fā)酵70 h。

1.4 蛋白質(zhì)電泳

12.5%SDS-PAGE電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳參照文獻［17］。低相對分子質(zhì)量標準蛋白購于Takara公司。

1.5 酯酶染色

準確稱取100 mg α-醋酸萘酯和100 mg β-醋酸萘酯，在2 mL丙酮中完全溶解，加入100 mg固藍B，混合均勻。用0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液定容至100 mL。將膠置于搖床上緩慢搖動，37℃、55 r/min，染色 1.5 h［18］。

1.6 非解聚的聚丙烯酰胺凝膠電泳

非解聚聚丙烯酰胺電泳參照Rousselot等［19］的方法。上樣緩沖(pH 6.8):0.16 mol/L Tris，7.95%SDS，25.5% 甘油，0.05%溴酚藍。處理好的試樣40℃ 水浴5 min，80/120 V SDS-PAGE電泳，電泳后水洗膠10 min，置于體積分數(shù)0.5%TritonX-100的Tris-HCl(100 mmol/L，pH 7.5)緩沖液中過夜復(fù)性，酯酶同工酶染色，得到酯酶染色條帶，水洗后進行考馬斯亮藍染色。

1.7 乙酰木聚糖酯酶活力的測定

以對硝基苯酚醋酸酯為底物，410 nm下檢測酶水解底物產(chǎn)生的對硝基苯酚的吸光值，測定方法參照文獻［12］。1個單位酶活定義為標準條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽胞桿菌酯酶同工酶

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳及酯酶同工酶染色對發(fā)酵后的上清液進行電泳分析，表明枯草芽胞桿菌可分泌一種酯酶(圖1)。

圖1 枯草芽胞桿菌粗酶液的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.1 Native PAGE analysis of the culture supernatant from Bacillus subtilis.

采用非解聚丙烯酰胺凝膠電泳和酯酶染色與考馬斯亮藍染色結(jié)合染色法確定酯酶相對分子質(zhì)量，試樣的處理和電泳方法按照文獻［19］。試樣未經(jīng)煮沸，未加入巰基乙醇，電泳過程在冰浴中進行，以確保酯酶處于聚合狀態(tài)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，酯酶相對分子質(zhì)量為1.07×105。

2.2 枯草芽胞桿菌脂肪酶Ⅰ氨基酸序列的鑒定

圖2 枯草芽胞桿菌脂肪酶相對分子質(zhì)量Fig.2 Molecular weight of esterase 1 from Bacillus subtilis

將鑒定枯草芽胞桿菌CICC 20034酯酶的電泳條帶切下(圖2，泳道2中相應(yīng)的酯酶條帶)，對其進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定(LC-MS/MS)。經(jīng)蛋白質(zhì)質(zhì)譜專用搜索系統(tǒng)Mascot搜索得到的蛋白鑒定結(jié)果如表1所示。該酯酶蛋白與乙酰木聚糖酯酶的蛋白分數(shù)為655(遠大于閥值53)，二級覆蓋率達到34%，氨基酸序列與解淀粉芽胞桿菌FZB42的乙酰木聚糖酯酶最為接近(表1和圖3)。乙酰木聚糖酯酶活力的測定多以醋酸酯(對硝基苯酚醋酸酯、醋酸萘酯)為反應(yīng)底物，本研究中酯酶對醋酸萘酯的高活性(圖1)與蛋白鑒定結(jié)果相一致。

解淀粉芽胞桿菌FZB42的單體相對分子質(zhì)量為3.56×104，而天然狀態(tài)下枯草芽胞桿菌酯酶的相對分子質(zhì)量為1.07×105，表明該酯酶自然狀態(tài)下很可能為多聚體?，F(xiàn)今，解淀粉芽胞桿菌FZB42(芽胞桿菌亞種916及芽胞桿菌亞種5B6)的乙酰木聚糖酯酶并未表征。Bacillus subtilis 168(GenBank:NP_388200.1 )、Bacillussubtilis ATCC6633(GenBank:ZP_06875135.1)、Bacillus pumilus(GenBank:2XLC_A)的乙酰木聚糖酯酶在自然狀態(tài)下分別為六聚體、單體、六聚體，相對分子質(zhì)量分別為2.20 ×105、4.5 ×105和1.90 ×105［12，20-21］?？莶菅堪麠U菌CICC 20034乙酰木聚糖酯酶具有相對分子質(zhì)量1.07×105。與已報道的酯酶有顯著的差異，值得進一步表征和深入研究。

表1 枯草芽胞桿菌CICC 20034酯酶Ⅰ的蛋白質(zhì)譜鑒定Table 1 Identification of esteraseⅠfrom Bacillus subtilis CICC 20034 via protein mass spectrometry

圖3 枯草芽胞桿菌CICC 20034酯酶Ⅰ的蛋白質(zhì)譜鑒定Fig.3 Identification of esterase Ⅰ from Bacillus subtilis CICC 20034 by protein mass spectrometry

2.3 誘導(dǎo)劑對枯草芽胞桿菌酯酶活性的影響

乙酰木聚糖酯酶為木聚糖降解酶系中的一員，天然木聚糖及其降解物，如木聚糖、殼聚糖、玉米芯粉、木糖等［11-12］可以誘導(dǎo)乙酰木聚糖酯酶的合成。常見誘導(dǎo)劑及短鏈脂肪酸酯——乙酸乙酯(C2∶0)、三丁酸甘油酯(C4∶0)對枯草芽胞桿菌CICC 20034產(chǎn)胞外酯酶活力的作用，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:不添加任何誘導(dǎo)劑時，枯草芽胞桿菌CICC 20034可組成型表達一定量的酯酶，比酶活為0.23 U/mL;添加木聚糖、殼聚糖、玉米芯粉和三丁酸甘油酯對發(fā)酵產(chǎn)酶幾乎無誘導(dǎo)作用;乙酸乙酯為最佳誘導(dǎo)劑，體積酶活為0.62 U/mL;木糖也有顯著的誘導(dǎo)作用，酯酶體積酶活為0.46 U/mL，比不添加誘導(dǎo)劑酶活力分別提高了169%和100%。已報道的野生細菌產(chǎn)乙酰木聚糖酯酶的能力如表2所示，本研究中枯草芽胞桿菌體積酶活0.62 U/mL，CICC20034產(chǎn)乙酰木聚糖酯酶為現(xiàn)今報道的野生細菌乙酰木聚糖酯酶達到最高活性，以后可通過構(gòu)建工程菌來進一步提高活力。

表2 細菌乙酰木聚糖酯酶的發(fā)酵活力Table 2 Production of acetyl xylan esterases from bacteria

圖4 誘導(dǎo)劑對枯草芽胞桿菌CICC 20034酯酶Ⅰ活性的影響Fig.4 Effects of inducers on activity of esterase Ⅰfrom Bacillus subtilis CICC 20034

枯草芽胞桿菌CICC 20034的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線如圖5所示。由圖5可知:發(fā)酵體系中無誘導(dǎo)劑存在時，發(fā)酵前期(0～20 h)產(chǎn)酶很不穩(wěn)定，后期產(chǎn)酶需要發(fā)酵時間較長(＞50 h)。以乙酸乙酯和木糖為誘導(dǎo)劑后，酯酶可以穩(wěn)定合成，產(chǎn)酶時間提前至30～50 h。而Degrassi等［12］報道的野生短小芽胞桿菌乙酰木聚糖酯酶發(fā)酵產(chǎn)酶時間集中于40～72 h。

圖5 枯草芽胞桿菌CICC 20034發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig.5 Time course of esterase Ⅰ production by Bacillus subtilis CICC 20034

3 結(jié)論

枯草芽胞桿菌CICC 20034可分泌一種高相對分子質(zhì)量的酯酶，自然狀態(tài)下相對分子質(zhì)量為1.07×105，經(jīng)蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定為乙酰木聚糖酯酶，單體相對分子質(zhì)量為3.56×104，乙酸乙酯為枯草芽胞桿菌CICC 20034產(chǎn)乙酰木聚糖酯酶的最佳誘導(dǎo)劑，發(fā)酵液中酯酶體積酶活為0.62 U/mL，為已知報道的野生細菌乙酰木聚糖酯酶的最高酶活?？莶菅堪麠U菌CICC 20034乙酰木聚糖酯酶具有鮮見報道的相對分子質(zhì)量特征和高酯酶活性，具有廣闊的應(yīng)用和研究前景。

［1］Biely P.Microbial carbohydrate esterases deacetylating plant polysaccharides［J］.Biotechnol Adv，2012，30(6):1575-1588.

［2］Zhang J，Siikaaho M，Tenkanen M，et al.The role of acetyl xylan esterase in the solubilization of xylan and enzymatic hydrolysis of wheat straw and giant reed［J］.Biotechnol Biofuels，2011，4(1):60.

［3］Montoro-García S，Gil-OrtizF，Navarro-FernándezJ，etal.Improved cross-linked enzyme aggregates for the production of desacetyl β-lactam antibiotics intermediates［J］.Biores Technol，2010，101(1):331-336.

［4］Ding S，Cao J，Zhou R，etal.Molecularcloning，and characterization of a modular acetyl xylan esterase from the edible straw mushroom Volvariella volvacea［J］.FEMS Microbiol Lett，2007，274(2):304-310.

［5］Poutanen K，Sunberg M.An acetyl esterase of Trichoderma reesei and its role in the hydrolysis of acetyl xylans［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1988，28(4/5):419-424.

［6］Khan A W，Lamb K A，Overend R P.Comparison of natural hemicellulose and chemically acetylated xylan as substrates for the determination of acetyl-xylan esterase activity in Aspergilli［J］.Enzyme Microb Technol，1990，12(2):127-131.

［7］Chavez R，Bull P，Eyzaguirre J.The xylanolytic enzyme system from the genus Penicillium［J］.J Biotechnol，2006，123(4):413-433.

［8］Biely P，MacKenzie C R，Schneider H.Production of acetyl xylan esterase by Trichoderma reesei and Schizophllum commun［J］.Can J Microbiol，1988，34(6):767-772.

［9］Lee H，To R J，Latta R K，et al.Some properties of extracellular acetylxylan esterase produced by the yeast Rhodotorula mucilaginosa［J］.App Environ Microbiol，1987，53(12):2831-2834.

［10］Poutanen K，R?tt?M，Puls J，et al.Evaluation of different microbial xylanolytic systems［J］.J Biotechnol，1987，6:49-60.

［11］Chungool W，Thong Kaw W，Raweesri P，et al.Production，purification，and characterization of acetyl esterase from Streptomyces sp PC22 and its action in cooporation with xylanolytic enzymes on xyron degradation［J］.World J Microbiol Biotechnol，2008，24(4):549-556.

［12］Degrassi G，Okek B C，Bruschi C V，et al.Purification andcharacterization of an acetyl xylan esterase from Bacillus pumilus［J］.Appl Envison Microbid，1998，64(2):789-792.

［13］Yang C H，Liu W H.Purification and properties of an acetylxylan esterase from Thermobifida fusca［J］.Enzyme Microb Technol，2008，42(2):181-186.

［14］McDermid K P，MacKenzie C R，F(xiàn)orsberg C W.Esterase activities of Fibrobacter succinogenes subsp.succinogenes S85［J］.Appl Environ Microbiol，1990，56(1):127-132.

［15］Lorenz W W，Wiegel J.Isolation，analysis，and expression of two genes from Thermoanaerobacterium sp.strain JW/SL YS485:a beta-xylosidase and a novel acetyl xylan esterase with cephalosporin C deacetylase activity［J］.J Bacteriol，1997，179(17):5436-5441.

［16］Krastanova I，Guarnaccia C，Zahariev S，et al.Heterologous expression，purification，crystallization，X-ray analysis and phasing of the acetyl xylan esterase from Bacillus pumilu［J］.Biochim Biophys Acta(BBA):Proteins and Proteomics，2005，1748(2):222-230.

［17］馬吉勝.枯草桿菌脂肪酶的基因克隆、定向進化與非水酶學(xué)研究［D］.長春:吉林大學(xué):2005.

［18］Kandzia R，Grimm R，Eckerskorn C，et al.Purification and characterization of lanatoside 15'-O-acetylesterase from Digitalis lanata Ehrh［J］.Planta，1998，204(3):383-389.

［19］Rousselot M，Jaenicke E，Lamkemeyer T，et al.Native and subunit molecular mass and quarternary structure of the hemoglobin from the primitive branchiopod crustacean Triops cancriformis［J］.FEBS J，2006，273(17):4055-4071.

［20］Vincent F，Charnock S J，Verschueren K H G，etal.Multifunctional xylooligosaccharide/cephalosporin C deacetylase revealed by the hexameric structure of the Bacillus subtilis enzyme at 1.9? resolution［J］.J Mol Biol，2003，330(3):593-606.

［21］Martínez-Martínez I，Navarro-Fernández J，Lozada-Ramírez D J，et al.YesT:A new rhamnogalacturonan acetyl esterase from Bacillus subtilis［J］.Proteins，2008，71(1):379-388.

［22］Mitsushima K，Takimoto A，Sonoyama T，et al.Gene cloning，nucleotide sequence，and expression ofa cephalosporin-C deacetylase from Bacillus subtilis［J］.Appl Environ Microbiol，1995，61(6):2224-2229.