張海靈，高秀珍，陳 曦，任 杰，馮進(jìn)輝，張同存，吳洽慶，朱敦明

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457;2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308)

烯烴的不對(duì)稱加氫反應(yīng)可以同時(shí)引入兩個(gè)手性中心，在不對(duì)稱合成技術(shù)中是非常重要的一類反應(yīng)，是合成很多精細(xì)化工品的必要步驟。目前以金屬催化劑為媒介的金屬催化不對(duì)稱加氫反應(yīng)應(yīng)用較為廣泛，但是金屬催化過(guò)程所需要的金屬催化劑價(jià)格昂貴，氫氣易燃易爆，產(chǎn)物中殘留重金屬，產(chǎn)品構(gòu)型受限制等限制了其應(yīng)用［1－2］，烯酮/烯酯還原酶則是一類可以溫和實(shí)現(xiàn)C＝C不對(duì)稱還原的生物催化劑，可以與金屬催化互補(bǔ)［3］。目前利用烯酮/烯酯還原酶催化的有價(jià)值的反應(yīng)大都是用全細(xì)胞來(lái)催化完成的［4－7］。利用微生物細(xì)胞雖然可以高立體選擇性地還原多種α，β－不飽和醛或酮，但是對(duì)還原C＝C鍵和C＝O鍵的化學(xué)選擇性通常較弱，這是因?yàn)榧?xì)胞中還存在醇脫氫酶，從而產(chǎn)生副產(chǎn)物，導(dǎo)致總產(chǎn)率降低［8－9］。為了排除這一干擾，近幾年來(lái)人們傾向于對(duì)烯酮/烯酯還原酶進(jìn)行分離純化后從事底物譜及其應(yīng)用研究，從而最大限度地消除各種副反應(yīng)的發(fā)生，這不僅增強(qiáng)反應(yīng)的化學(xué)和立體選擇性，而且還大大增加了產(chǎn)率［10－13］。

筆者對(duì)Aspergillus oryzae RIB40中的烯酮/烯酯還原酶進(jìn)行了異源表達(dá)，鎳柱純化的蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)及底物譜的分析。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

米曲霉A.oryzae RIB40，由華南理工大學(xué)潘力教授提供;宿主菌大腸桿菌 E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和克隆載體pUC19，由中國(guó)科學(xué)院工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)載體pET32a(+)，購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基 (g/L):酵母提取物5，蛋白胨10，葡萄糖 20，KCl 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02;pH 5.5。

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10;pH 7.0。

抗生素使用質(zhì)量濃度為100 μg/mL，使用氨芐青霉素(Amp)。

1.1.3 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ，購(gòu)自Fermentas公司;PrimeSTAR HS DNA聚合酶和DNA連接試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司;RNA酶，購(gòu)自Sigma公司;DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;NAD(P)H和 NAD(P)，購(gòu)自美國(guó)Codexis公司;所有的底物，購(gòu)自Alfa Aesar或Sigma Aldrich公司;核酸染色劑GelRed，購(gòu)自Biotium Inc公司;質(zhì)粒提取試劑盒和蛋白定量試劑盒，購(gòu)自北京康為試劑有限公司。

離心機(jī)分別購(gòu)自美國(guó)Eppendorf和Thermo公司;高壓勻漿機(jī)，購(gòu)自德國(guó)APV公司;蛋白純化儀和Superdex 20010/300 GL，購(gòu)自美國(guó)GE公司;酶標(biāo)儀SPECTRAMAX M2e，購(gòu)自美國(guó)MD公司;氣相色譜儀Agilent 7890，購(gòu)自安捷倫公司;手性柱CP ChiraSil DEX(25 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，購(gòu)自德國(guó)Varian 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

A.oryzae RIB40菌株經(jīng)YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d(30℃、200 r/min)后，4000 r/min 4℃離心10 min收集菌體;菌體凍干后液氮研磨成粉末，溶于600 μL 裂解液(50 mmol/L NaOH，1 mmol/L EDTA，1%Triton X－100)中重懸，并加入體積分?jǐn)?shù)1%β－巰基乙醇;65℃孵育1 h后，12000 r/min離心10 min;上清用酚 －氯仿萃取2次后，異丙醇沉淀DNA，所得DNA沉淀用含有100 μg/mL RNA酶的重蒸水重懸，37℃孵育1 h以便DNA能完全溶解。

1.2.2 基因asper的克隆

根據(jù) A.oryzae RIB40烯酮/烯酯還原酶基因(Genbank ID:XM_001727598.1)序列設(shè)計(jì)引物為:5'－GGGGTACCGACGACGACGACAAGGGATCCATCTCTTCCACATC－3'(下劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)，黑體部分為腸激酶酶切位點(diǎn))和5'－CGGAATTCCTAAAGTGCACGCCAGAACT－3'(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。以A.oryzae RIB40基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;98℃，30 s;55℃，45 s;72℃，100 s;30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用含有核酸染色劑GelRed的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。純化后的DNA片段連接到pUC19(SmaⅠ單酶切)線性載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有100 mg/L氨芐青霉素、40 mg/L X-gal和100 μmol/L IPTG的LB平板上37℃培養(yǎng)16 h，隨機(jī)挑選白色克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和序列分析，命名為pUC-asper。

1.2.3 asper基因表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白AspER的表達(dá)純化

重組質(zhì)粒pUC-asper經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ消化后連接到同樣內(nèi)切酶消化的pET32a(+)上，得到的重組質(zhì)粒pET32a(+)-asper轉(zhuǎn)入 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp抗性的LB平板上37℃培養(yǎng)，提質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中得到重組工程菌。

將單菌落接種于含有Amp的LB培養(yǎng)液的試管中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜;以1%接種量接種于含有同樣抗生素的800 mL LB培養(yǎng)基，37℃下200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)加入0.1 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。培養(yǎng)后的菌體在7000 r/min離心15 min的條件收集后洗滌并重懸于緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，250 mmol/L NaCl)中，高壓勻漿破碎細(xì)胞。所得細(xì)胞裂解液在4℃下經(jīng)14000 r/min離心30 min后取上清，0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行親和層析純化目的蛋白，咪唑濃度梯度洗脫獲得目的蛋白。所得目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，并根據(jù)蛋白定量試劑盒的操作流程測(cè)定蛋白濃度，隨后加入50%甘油保存在－20℃中備用。

1.2.4 酶活測(cè)定及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

AspER酶活性的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)采用微孔板反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為200 μL，包含5 mmol/L 2－環(huán)己烯酮(DMSO溶解)，0.5 mmol/L NADPH和100 μg/mL AspER。反應(yīng)體系的配制采用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)。反應(yīng)的發(fā)生以加入NADPH作為啟動(dòng)。反應(yīng)通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)25℃下340 nm吸光值的變化來(lái)測(cè)定酶對(duì)底物的活性大小。NADPH摩爾消光系數(shù)為6.22/(mmol·cm)。一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘內(nèi)消耗1 μmol NADPH所需的酶量。

AspER對(duì)底物2－環(huán)己烯酮的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定方法同樣按照上述酶活分析方法進(jìn)行。2－環(huán)己烯酮的濃度范圍設(shè)定為0.1～10 mmol/L。反應(yīng)速度定義為每分鐘消耗NADPH的毫摩爾數(shù)。采用雙倒數(shù)法計(jì)算Km和Vmax。

1.2.5 酶聚集狀態(tài)的確定

AspER在天然狀態(tài)下的聚集狀態(tài)通過(guò)結(jié)合分子排阻來(lái)進(jìn)行確定。所用層析柱為Superdex 20010/300 GL，流動(dòng)相為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含有150 mmol/L NaCl)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為:Ovalbumin(4.3 ×104)，Conalbumin(7.5 ×104)，Conalbumin(1.58 ×105)，F(xiàn)erritin(4.4×105)，Thyroglobulin(6.69×105)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白與目的蛋白的保留體積推算AspER的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.6 pH和溫度對(duì)酶活的影響

通過(guò)測(cè)定不同pH緩沖液中AspER的酶活，確定該蛋白的最適pH。采用的緩沖液分別為檸檬酸－磷酸緩沖液(pH 2.2～8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 7.2～9.4)。最適反應(yīng)溫度則是通過(guò)測(cè)定不同溫度下的酶活確定，溫度范圍為25～45℃，5℃為一個(gè)間隔。為了探究其溫度穩(wěn)定性，一定濃度的蛋白溶液在不同溫度下孵育100 min，每20 min取樣1次(第一次取樣時(shí)孵育10 min)，檢測(cè)蛋白在25℃下的殘余酶活力(以孵育前的酶活力為100%)。所有測(cè)定方法均按照1.2.4標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定條件測(cè)定上述不同條件的酶活，每個(gè)反應(yīng)3個(gè)平行。

1.2.7 底物譜分析

按照1.2.4酶活測(cè)定方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的α，β－不飽和羰基等化合物進(jìn)行酶活性檢測(cè)以探究AspER的底物譜。考慮到底物水溶性差，所有的底物均溶解到二甲基亞砜(DMSO)體積分?jǐn)?shù)1%中，其他成分溶解在pH 7.0磷酸鹽緩沖液。

1.2.8 底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物 e.e.(或 d.e.)值的測(cè)定

AspER對(duì)有活性的手性底物的立體選擇性的分析采用葡萄糖脫氫酶耦聯(lián)的輔酶再生體系進(jìn)行。1 mL反應(yīng)體系(100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)中包含:葡萄糖9 mg，D－葡萄糖脫氫酶1 mg，β－NADP 1 mg，AspER 150 μg，底物 2 mg。設(shè)置的反應(yīng)在37 ℃、200 r/min的條件下反應(yīng)24 h后用相同體積的甲基叔丁基醚萃取，所得有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后氣相色譜儀檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物 e.e.(或 d.e.)值。

2 結(jié)果和討論

2.1 AspER的表達(dá)和純化

考慮到蛋白可溶表達(dá)及純化的需要，在載體構(gòu)建過(guò)程中采用了pET32a(+)上的His-tag和Trx-tag。AspER，在E.coli BL21(DE3)中以可溶形式表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA純化，蛋白純度提高 1.9倍，回收率為60.62%;洗脫后的蛋白經(jīng)腸激酶切除N端融合表達(dá)的標(biāo)簽后，總活力提高到53.265 U(表1)，比純化前和純化后未切除N端標(biāo)簽時(shí)都高，因此認(rèn)為蛋白N端融合表達(dá)的標(biāo)簽影響了蛋白的活性［14］。根據(jù)蛋白的氨基酸殘基數(shù)預(yù)測(cè)蛋白單體大小為47.1×103，與SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(圖1)近似。根據(jù)分子篩凝膠層析結(jié)果推算，AspER的相對(duì)分子質(zhì)量為9.1×104，由此可推斷該酶以二聚體形式存在。當(dāng)以NADPH作為輔酶時(shí)，酶的活力約為NADH作為輔酶時(shí)酶活力的8倍，說(shuō)明AspER為依賴于NADPH的氧化還原酶。

表1 AspER的純化結(jié)果Table 1 Purification of AspER

圖1 AspER的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of AspER

2.2 酶的最適反應(yīng)pH、溫度和溫度穩(wěn)定性

圖2為AspER酶的最適反應(yīng)pH、溫度及溫度穩(wěn)定性結(jié)果。由圖2可知:以2－環(huán)己烯酮為底物，AspER在pH 7.0～8.0時(shí)表現(xiàn)出了最高活性，低于pH 5.0的條件下酶完全失活(圖2(a))。酶的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性方面，AspER在40℃表現(xiàn)出了最高活性(圖2(b))，在25～40℃范圍孵育100 min后酶活穩(wěn)定，而在45℃ 孵育10 min后酶活失去將近40%，40 min后酶基本完全失活(圖2(c))。

2.3 酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

根據(jù)雙倒數(shù)圖(圖3)計(jì)算AspER對(duì)2－環(huán)己烯酮的Km和kcat分別為(2.45±0.36)mmol/L和(4.4±0.4)×103s－1。文獻(xiàn)報(bào)道已知烯酮/烯酯還原酶對(duì)2－環(huán)己烯酮的 Km為 0.01 ～ 5.5 mmol/L［15－19］。AspER對(duì)2－環(huán)己烯酮的Km和kcat與來(lái)源于Lactobacillis casei str.Zhang 的烯酮/烯酯還原酶(LacER)相近，LacER是NADH依賴型，而AspER更傾向于以NADPH為輔酶［22］。

2.4 酶的底物特異性

用純化后的AspER對(duì)不同種類的α，β－不飽和羰基化合物(醛類、環(huán)酮類、馬來(lái)酰亞胺及其衍生物、羧酸和酯等)進(jìn)行了底物譜篩選。以AspER對(duì)2－環(huán)己烯酮的比活定義為100，計(jì)算該酶對(duì)所有底物的相對(duì)酶活(表2)。由表2可知:AspER可以催化環(huán)狀烯酮的C＝C雙鍵的還原，環(huán)上取代基的位置對(duì)催化活性有很大的影響，如2－甲基環(huán)戊烯酮可以被還原，而對(duì)3－甲基環(huán)戊烯酮?jiǎng)t沒(méi)有活性。該酶對(duì)脂肪族的醛和酮有催化活性，但不能催化苯基取代的α，β－不飽和醛、酮、羧酸及其酯的C＝C雙鍵的還原。AspER對(duì)馬來(lái)酰亞胺及其衍生物有較高的活性，取代基的位置及大小對(duì)酶活有不同程度的影響。AspER對(duì)溴代馬來(lái)酰亞胺和溴代馬來(lái)酸酐，以及對(duì)苯基馬來(lái)酰亞胺和苯基馬來(lái)順酐有相似的活性;但對(duì)馬來(lái)酰亞胺和2－甲基馬來(lái)酰亞胺都有較高的活性，而對(duì)馬來(lái)酸酐和2－甲基馬來(lái)酸酐卻沒(méi)有活性。至于AspER對(duì)馬來(lái)酰亞胺和馬來(lái)酸酐表現(xiàn)出如此有趣現(xiàn)象的原因，目前還不清楚。

圖2 pH和溫度對(duì)AspER酶活的影響及酶活穩(wěn)定性(以2-環(huán)己烯酮為底物)Fig.2 Effects of pH and temperature on AspER enzyme activities and its stabilities

圖3 雙倒數(shù)作圖法計(jì)算AspER酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.3 Lineweaver-Burk plot of AspER

?

?

2.5 轉(zhuǎn)化率和 e.e.(或 d.e.)值分析

用AspER對(duì)少數(shù)幾個(gè)有活性的α，β－不飽和羰基化合物做了催化反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)底物和消旋體產(chǎn)物為對(duì)照，用氣相色譜儀檢測(cè)了它們的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的 e.e.(或 d.e.)值［20］(表 3)。由于 2 － 甲基環(huán)戊烯酮產(chǎn)物的消旋體保留時(shí)間接近，不能將它們分開(kāi)，所以無(wú)法確定底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物e.e.值;由于沒(méi)有溴代馬來(lái)酸酐的消旋體，所以沒(méi)有檢測(cè)溴代馬來(lái)酸酐的反應(yīng)結(jié)果。由表3看出:AspER對(duì)2－甲基馬來(lái)酰亞胺具有較高的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性(e.e.值均高于99%);對(duì)R－香芹酮的轉(zhuǎn)化率高于S－香芹酮，但具有近似的立體選擇性;對(duì)2－苯基馬來(lái)酰亞胺的轉(zhuǎn)化率雖然較高，但立體選擇性較低。

表3 AspER催化還原反應(yīng)的立體選擇性Table 3 Stereoselectivity of bioreduction catalyzed by AspER

3 結(jié)論

以米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因組DNA為模版，成功克隆、表達(dá)和分離純化出一種烯酮/烯酯還原酶AspER。該酶可以利用 NADH和NADPH作為輔酶，但對(duì)NADPH有較高的偏好性。AspER對(duì)馬來(lái)酰亞胺及其衍生物表現(xiàn)出較高的催化活性，催化2－甲基馬來(lái)酰亞胺的高效立體選擇性還原(轉(zhuǎn)化率和e.e.值均高于99%)，目前烯酮/烯酯還原酶催化馬來(lái)酰亞胺及其衍生物的還原的研究還很少，AspER可望應(yīng)用于該類化合物的不對(duì)稱還原。

［1］Tuttle J B，Ouellet S G，David W.Organocatalytic transfer hydrogenation of cyclic enones［J］.J Am Chem Soc，2006，128(39):12662-12663.

［2］Ouellet S G，Tuttle J B，David W.Enantioselective organocatalytic hydride reduction［J］.J Am Chem Soc，2005，127(1):32-33.

［3］Williams R，Bruce N.New uses for an old enzyme-the old yellow enzyme family of flavoenzymes［J］.Microbiology，2002，148(6):1607-1614.

［4］Swiderska M A，Stewart J D.Asymmetric bioreductions of β-nitro acrylates as a route to chiral β 2-amino acids［J］.Org Lett，2006，8(26):6131-6133.

［5］Wada M，Yoshizumi A，Noda Y，et al.Production of a doubly chiral compound，(4R，6R)-4-hydroxy-2，2，6-trimethylcyclohexanone，by two-step enzymatic asymmetric reduction［J］. Appl Environ Microbiol，2003，69(2):933.

［6］Kataoka M，Kotaka A，Hasegawa A，et al.Old yellow enzyme from Candida macedoniensis catalyzes the stereospecific reduction of the C ＝C bond of ketoisophorone［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(12):2651-2657.

［7］Ohta H，Kobayashi N，Ozaki K.Asymmetric reduction of nitro olefins by fermenting bakers'yeast［J］.J Org Chem，1989，54(8):1802-1804.

［8］Müller A，Hauer B，Rosche B.Enzymatic reduction of the α，βunsaturated carbon bond in citral［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2006，38(3/4/5/6):126-130.

［9］Hall M，Hauer B，Stuermer R，et al.Asymmetric whole-cell bioreduction ofan ［alpha］，［beta］-unsaturated aldehyde(citral):co mpeting prim-alcohol dehydrogenase and C ＝C lyaseactivities［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2006，17(21):3058-3062.

［10］Mangan D，Miskelly I，Moody T S.A three-enzyme system involving an ene-reductase for generating valuable chiral building blocks［J］.Adv Syn Catal，2012，354(11/12):2185-2190.

［11］Brenna E，Gatti F G，Manfredi A，et al.Enoate reductase mediated preparation of(S)-methyl 2-bromobutanoate，a useful key intermediate for the synthesis of chiral active pharmaceutical ingredients［J］.Org Proc Res Dev，2012，16(2):262-268.

［12］Yanto Y，Winkler C K，Lohr S，et al.Asymmetric bioreduction of alkenes using ene-reductases YersER and KYE1 and effects of organic solvents［J］.Org Let，2011，13(10):2540-2543.

［13］Mueller N J，Stueckler C，Hauer B，et al.The substrate spectra of pentaerythritol tetranitrate reductase，morphinone reductase，N-ethylmaleimide reductase and estrogen-binding protein in the asymmetric bioreduction of activated alkenes［J］.Adv Syn Catal，2010，352(2/3):387-394.

［14］翟光磊，鐘良瑋.N－末端標(biāo)簽對(duì)人硫氧還蛋白反應(yīng)特點(diǎn)的影響［J］.生物物理學(xué)報(bào)，2009，25(增刊1):371-372.

［15］Chaparro-Riggers J，T Rogers，E Vazquez-Figueroa，etal.Comparison of three enoate reductases and their potential use for biotransformation［J］.Adv Syn Catal，2007，349:1521-1531.

［16］Fitzpatric，K T，NAmrhein，Macheroux P.Characterization of YqjM，an old yellow enzyme homolog from Bacillus subtilis involved in the oxidative stress response［J］.J Biol Chem，2003，278:19891-19897.

［17］French C E，Bruce N C.Purification and characterization 484 of morphinone reductase from Pseudomonas putida M10［J］.Biochem J，1994，301:97-103.

［18］French C，Nicklin S，Bruce N C.Sequence and properties of pentaerythritol tetranitrate reductase from Enterobacter cloacae PB2［J］.J Bacteriol，1996，178:6623-6627.

［19］Brown B J，Z Deng，P A Karplus，et al.On the active site of old yellow enzyme［J］.J Biol Chem，1998，273:32753.

［20］Gao X，Ren J，Wu Q，et al.Biochemical characterization and substrate profiling of a new NADH-dependent enoate reductase from Lactobacillus casei［J］.Enzyme Microb Technol，2012，51:26-34.