劉佳言，錢 樂，鄭高偉，許建和

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

傳統(tǒng)的生物催化劑篩選方法通常是從土壤中分離微生物，既耗時(shí)又耗力［1］?，F(xiàn)在隨著微生物基因組數(shù)據(jù)的迅速增長，在實(shí)驗(yàn)室中得到具有某一功能的酶正變得越來容易［2-4］?？莶菅堪麠U菌的基因組序列早在1997年就已經(jīng)公布［5］，30個(gè)基因被預(yù)測可能為水解酶，其中一些酶已經(jīng)被鑒定和表征，例如Lip A 和 Lip B［6-9］。另外，來自B.subtilis Thai I-8的羧酸酯酶NP(由nap基因編碼)已被用于拆分非甾體抗炎藥物［10］。酶 YbfK(由 ybfK基因編碼)，被報(bào)道能催化水解外消旋的 IPG(1，2-O-isopropyl-ideneglycerol)辛酸酯生成e.e.值為 99.9%的(S)-IPG［11-12］。來自枯草芽胞桿菌 NRRL B8079的對硝基芐基酯酶也在1995年在大腸桿菌中被克隆、表達(dá)和表征［12-13］?？莶菅堪麠U菌DSM402中基因名為yvak的酯酶也被發(fā)現(xiàn)能催化水解1-苯乙醇乙酸酯并具有很高的對映選擇性(E＞150)［14］。枯草芽胞桿菌ECU0554的酯酶能在高底物濃度(1 mol/L)下催化拆分薄荷醇，具有極高的對映選擇性(E＞200)，并被克隆表達(dá)于大腸桿菌中［15-16］。然而，枯草芽胞桿菌中仍有許多水解酶的性質(zhì)和功能尚未被研究報(bào)道。

嘗試對模式菌枯草芽胞桿菌168的基因組進(jìn)行挖掘，試圖發(fā)現(xiàn)具有應(yīng)用潛力的水解酶。本工作成功表達(dá)了7個(gè)具有明顯酯水解活力的枯草芽胞桿菌酯酶，其氨基酸序列分析表明，它們分別屬于5個(gè)不同的亞家族，具有遺傳多樣性。接著通過高通量的方法分別研究它們對結(jié)構(gòu)多樣的酸和醇的底物特異性和多樣性，并且考察其對工業(yè)相關(guān)手性酯水解的對映選擇性。

1 材料與方法

1.1 菌株

枯草芽胞桿菌(B.subtilis 168)由中科院植物生理生態(tài)研究所楊晟研究員饋贈(zèng)。大腸桿菌E.coli DH5α用于克隆實(shí)驗(yàn)，E.coli BL21(DE3)用于重組酶的表達(dá)，皆為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10，蛋白胨10，酵母粉5;于121℃高壓滅菌20 min。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，Na2HPO48.95，KH2PO43.4，NH4Cl 2.67，Na2SO40.71，MgSO40.24，甘油 5，葡萄糖 0.5，乳糖 2;于115℃高壓滅菌30 min。

1.3 酯酶的克隆和表達(dá)

枯草芽胞桿菌168中30個(gè)預(yù)測為水解酶的基因被逐一克?。?］，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后酶切連接于表達(dá)載體pET-28a，并轉(zhuǎn)化到宿主E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行重組表達(dá)。

所有重組子在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子液(37℃)，在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基［17］中培養(yǎng)20 h(25℃)。細(xì)胞經(jīng)離心(6500 r/min 10 min)收集后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次(0.1 mol/L，pH 7.0)，再超聲破碎。以SDS-PAGE考察基因的表達(dá)情況，用Bradford法檢測蛋白濃度。破碎后的上清酶液凍干后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酶活檢測

重組酶酶活力檢測參照文獻(xiàn)［18］。酶活單位(U)定義為在檢測條件下每分鐘產(chǎn)生1.0 μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

1.5 底物特異性

1.5.1 酶對對硝基苯酚羧酸酯的底物特異性

利用對硝基苯酚酯酶促水解生成黃色的對硝基苯酚［19］檢測酯酶的活力，所用底物具有結(jié)構(gòu)多樣性(圖1)。配制底物母液，底物溶于二甲基亞砜(DMSO)，濃度為1 mmol/L。反應(yīng)體系為:酶溶液10 μL，底物母液50 μL 和 KPB 緩沖液140 μL(100 mmol/L，pH 7.0)。將以上溶液迅速加入96孔板放入酶標(biāo)儀，30℃振蕩10 s后，在404 nm下每隔20 s檢測1次吸光值，共10 min。

1.5.2 酶對不同醇乙酸酯的底物特異性

采用對硝基苯酚作為pH指示劑，檢測乙酸酯酶促水解所生成的乙酸量［20］，所用檢測底物見圖2。檢測液組成:30 mmol/L底物/乙腈溶液420 μL，乙腈470 μL，1 mmol/L對硝基苯酚溶液6 mL(溶于5.0 mmol/L BES緩沖液，pH 7.2)，以及5.0 mmol/L N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸BES緩沖液(pH 7.2)5.11 mL。取酶液5和100 μL上述檢測液快速加入96孔酶標(biāo)板，放入酶標(biāo)儀檢測。在25℃振蕩10 s，每30 s檢測404 nm處吸光值，共10 min，具體計(jì)算見式(1)。式中:dA/dt是每分鐘在404 nm處吸光值的變化值，cB是緩沖液濃度(mol/L)，cin是指示劑對硝基苯酚的濃度(mol/L)，Δε404是pH指示劑對硝基苯酚的質(zhì)子化和非質(zhì)子化2種結(jié)構(gòu)的消光系數(shù)之差(17300 mol-1·L·cm-1)，l是光程(酶標(biāo)板中 105 μL液體的光程為0.306 cm)，V為反應(yīng)體積。

圖1 用于表征枯草芽胞桿菌酯酶脂肪酸特異性的結(jié)構(gòu)多樣性對硝基苯酚酯Fig.1 Structure of p-nitrophenyl esters used for profiling substrate specificity of Bacillus subtilis esterases(BSEs)

圖2 用于表征枯草芽胞桿菌酯酶底物特異性的醇乙酸酯Fig.2 Acetyl esters of alcohols for fingerprinting substrate specificity of BSEs

1.6 酶促水解手性底物的對映選擇性

反應(yīng)液包括10 mmol/L底物(圖3)和酶溶液，反應(yīng)條件見表1。反應(yīng)試樣用乙酸乙酯萃取或直接取有機(jī)相，干燥后進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)或氣相色譜(GC)分析。酶的對映選擇性(E)根據(jù)文獻(xiàn)［21］中的公式計(jì)算。

圖3 用于評估枯草芽胞桿菌酯酶對映選擇性的工業(yè)相關(guān)底物Fig.3 Industrially relevant substrates for evaluating the enantioselectivity of BSEs

表1 酶催化手性底物水解的反應(yīng)條件和檢測方法Table 1 Reaction conditions and analytic methods for enzymatic hydrolysis of various substrates

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽胞桿菌酯酶(BSEs)的克隆、表達(dá)和進(jìn)化關(guān)系分析

30個(gè)枯草芽胞桿菌(B.subtilis)168的預(yù)測為酯水解酶的基因被克隆，N端加入His6標(biāo)簽在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，其中7個(gè)酶對對硝基苯酚乙酸酯和丁酸酯表現(xiàn)出明顯的水解活力:PnbA，YitV，YvaK，Nap，SrfAD，LipB 和 Cah，YitV 是首次被報(bào)道。利用Megalign(DBAStar)軟件對這些酯酶序列進(jìn)行進(jìn)化分析(圖4)。由圖4可知:它們屬于α/β-fold水解酶家族中5個(gè)不同的亞家族［22］:亞家族Ⅰ(LipB)，亞家族Ⅲ(Cah)，亞家族Ⅴ(Nap和YvaK)，亞家族Ⅵ(YitV)和亞家族Ⅶ(PnbA)。SrfAD與亞家族Ⅱ(GDSL亞家族)有最近的進(jìn)化關(guān)系，但是SrfAD并沒有Gly-Asp-Ser-(Leu)［GDS(L)］保守序列。因此，這些具有基因多樣性、屬于不同亞家族的酶，就有可能提供各種各樣的催化功能。

2.2 酯水解酶對不同羧酸的對硝基苯酚酯的底物特異性

通過高通量檢測7個(gè)枯草芽胞桿菌酯水解酶對不同羧酸的對硝基苯酚酯(1～14)的水解活力，考察它們對不同羧酸的底物特異性(圖1)，結(jié)果見圖5。由圖5可知這些酶除了Cah之外，大多對中短鏈脂肪酸(C4～C8)的對硝基苯酚酯表現(xiàn)出較高活力。Cah酶在以前的報(bào)道中為頭孢菌素C脫乙?；?，它對對硝基苯酚乙酸酯表現(xiàn)出專一性的高活力［23］。另外，有趣的是SrfAD酶對芳香羧酸酯中的底物13具有最高活力，這與其他酶不盡相同。

圖4 用MEGALIGN分析枯草芽胞桿菌中各酯水解酶的進(jìn)化關(guān)系Fig.4 Phylogenetic analysis of all esterases and lipases from Bacillus subtilis 168

圖5 用對硝基苯酚酯高通量表征7個(gè)枯草芽胞桿菌酯水解酶的脂肪酸特異性Fig.5 Substrate specificity of p-nitrophenyl esters of different fatty acids assayed in high-throughput format

2.3 酯水解酶對不同醇乙酸酯的底物特異性

以對硝基苯酚作為pH指示劑，檢測不同醇的乙酸酯(15～23)(圖2)水解所產(chǎn)生的酸度，由此考察酯水解酶對醇的底物特異性，結(jié)果見圖6。由圖6可知:Cah和PnbA酶對芳香醇乙酰酯(18～23)顯示出明顯的活力，但卻很難水解脂肪醇的乙酸酯(15～17)，這與文獻(xiàn)［15，23］報(bào)道的結(jié)果一致。除此之外，Nap酶對化合物18、19和22，YvaK酶對化合物19，也有活力。但其他3個(gè)酶LipB、SrfAD和YitV并未被檢測到明顯活力。

圖6 用乙酸酯高通量表征7個(gè)枯草芽胞桿菌酯水解酶的醇特異性Fig.6 Substrate specificity on acetyl esters of different alcohols assayed in high-throughput format

2.4 酯水解酶催化拆分工業(yè)相關(guān)手性化合物

在快速分析了7個(gè)酯水解酶的底物特異性后，又進(jìn)一步考察了這些酶對一些工業(yè)相關(guān)手性酯的對映選擇性水解。有關(guān)結(jié)果，如底物的 e.e.s或產(chǎn)物的e.e.p，底物的轉(zhuǎn)化率和對映體選擇率(E)等，列于表2。

大多數(shù)酶對外消旋手性芳基羧酸酯(24～27)的水解顯示出較低的對映選擇性(E＜10)，只有酶LipB水解底物24和酶Nap水解底物27時(shí)顯示出中等的對映選擇性(E分別為25.2和12.9)。而對于含有較大基團(tuán)的底物26和27，僅Nap顯示出顯著的活性。

底物28～32是手性中心位于醇端的羧酸酯。對于底物28和29，所有酶都顯示出一定的活力，而且Nap酶在催化水解底物28和29時(shí)顯示出極好的選擇性(E＞200)。但是，大多數(shù)酶對底物30、31和32沒有活力或活力很低，只有Cah對底物30和31顯示了很高活力，但其對映選擇性卻很低(E＜15)。YitV這個(gè)酶是第一次被表達(dá)和表征，它對底物29(2-萘乙醇乙酸酯)具有較高的對映選擇性(e.e.p＞95%)。此外還發(fā)現(xiàn)YitV酶在催化水解底物28(2-氯-1-苯乙醇乙酸酯)時(shí)，表現(xiàn)出不同于其他多數(shù)酶的獨(dú)特的對映體偏愛性。根據(jù)Kazlauskas規(guī)則［24］，仲醇羥基兩側(cè)取代基團(tuán)的“尺寸”大小，取決于酶催化2種對映異構(gòu)體速度的快慢，酶促水解(R)-型酯生成(R)-醇。2-氯-1-苯乙醇的羥基兩側(cè)取代基團(tuán)中，大基團(tuán)為苯基，中基團(tuán)為—CH2Cl，但由于有氯原子而導(dǎo)致基團(tuán)排序變化，普通酯酶/脂肪酶遵從Kazlauskas規(guī)則水解(S)-型酯，生成(S)-醇，但YitV在水解底物28(2-氯-1-苯乙醇乙酸酯)時(shí)選擇性相反，即生成(R)-氯醇，其對映選擇率(E)為13.5。

表2 7個(gè)枯草芽胞桿菌酯水解酶對手性工業(yè)相關(guān)產(chǎn)物的對映選擇性Table 2 Performances of the seven enzymes in enantioselective hydrolysis of severalindustrially relevant chiral esters

3 結(jié)論

通過基因組數(shù)據(jù)挖掘，從枯草芽胞桿菌168中克隆表達(dá)酯水解酶，其中7個(gè)酶表現(xiàn)出明顯的酯水解活力，它們分屬于5個(gè)不同的亞家族。利用顯色反應(yīng)和pH指示劑法高通量地繪制了這7個(gè)酯水解酶的底物指紋譜，分析了酶的底物特異性和多樣性。并且對這些酶催化拆分工業(yè)相關(guān)的手性化合物的對映選擇性進(jìn)行了考察，有趣的是，發(fā)現(xiàn)新酶YitV在水解仲醇乙酸酯時(shí)符合少見的反-Kazlauskas規(guī)則。本工作為通過基因組數(shù)據(jù)挖掘法發(fā)現(xiàn)有工業(yè)應(yīng)用潛力的酶并高通量地篩選合適底物提供了一個(gè)案例。

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