劉光偉 尹 娜 彌 娜 李 昕 李堯華 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學研究室，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京100053;2.北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實驗室，北京100053)

α－突觸核蛋白(α－synuclein，α－Syn)是由 140 個氨基酸組成的酸性蛋白質(zhì)，其纖維化過程中形成的可溶性寡聚體中間體被認為在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)病中起著重要作用［1］。然而，導致 α－Syn寡聚體在神經(jīng)元內(nèi)積聚的機制仍不十分清楚。近年來的研究表明，α－Syn寡聚體的形成及其在神經(jīng)元內(nèi)的積聚與其降解通路發(fā)生障礙有關。α－Syn的降解主要通過伴侶分子介導的自噬(chaperone mediated autophagy，CMA)進行［2］，而 CMA 對 α－Syn 的降解需要葡糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase，GBA)的正?；钚裕?－4］。GBA的基因突變不僅可以促進溶酶體貯存障礙的疾病——戈謝病(Gaucher’s disease)發(fā)生，而且其某些突變(N370S、L444P)可以引起PD以及明顯的路易體病變［5－6］。另有證據(jù)表明，GBA 突變攜帶者腦組織中的a－Syn寡聚體含量增加，而PD患者腦組織中的GBA活性和表達均降低［7－9］。這些研究結(jié)果提示GBA和α－Syn可能存在某種相互作用。筆者推測，GBA的活性下降很可能是導致神經(jīng)元內(nèi)α－Syn寡聚體增加并進一步引起細胞自噬異常的原因，后者可以促進細胞凋亡［10］。

在本研究中，筆者將利用MES23.5多巴胺神經(jīng)細胞作為研究對象，觀察抑制GBA活性后細胞內(nèi)α－Syn寡聚體含量的變化及其對自噬活性、氧化應激以及細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

MES23.5多巴胺能神經(jīng)細胞由美國休斯敦Baylor醫(yī)學院樂衛(wèi)東教授惠贈。DMEM/F12培養(yǎng)基購自GIBCO Invitrogen公司;胎牛血清購自Berlin公司;重組人α－Syn 蛋白由本室制備［11］;環(huán)己烯四醇－β－環(huán)氧化物(conduritol－β－epoxide，CβE)購自 Calbiochem 公司;GBA活性檢測試劑盒購自BioAssay Systems公司;Cyto－ID○R自噬檢測試劑盒購自Enzo Life Sciences公司;超氧化物陰離子熒光探針(DHE)購自碧云天生物技術研究所;丫靛橙和碘化丙啶購自Sigma－Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MES23.5細胞培養(yǎng)

MES23.5多巴胺能神經(jīng)細胞接種于鋪有多聚－L－賴氨酸的25 cm2培養(yǎng)瓶中，在含有5% 胎牛血清和Sato’s添加液的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)［11］。待細胞增生到適當密度后，根據(jù)不同實驗的需要，接種于鋪有多聚－L－賴氨酸的24孔板或35 mm2培養(yǎng)皿中。

1.2.2 培養(yǎng)細胞總蛋白的提取

細胞培養(yǎng)結(jié)束后棄培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS洗3次。收集細胞，4℃、10 000 r/min離心3 min。棄上清，用預冷的0.01 mol/L PBS清洗沉淀，4℃、10 000 r/min離心3 min。棄上清，向細胞沉淀中加入200 μL細胞提取液(50 mmol/L Tris－HCl pH 7.4，150 mmol/L NaCl，2%TritonX－100，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L EDTA)，混勻后冰上放置40 min。4℃、10 000 r/min離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 GBA活性的測定

按照GBA酶活性檢測試劑盒要求的方法操作。準備一個96孔板，根據(jù)實驗需要準備相應體積的工作液:200 μL檢測緩沖液+8 μL底物液/孔。在96孔板中分別加入超純水、校準液、樣品和準備好的工作液，使用酶標儀測定405 nm處反應前(0 min)的吸光度值。50℃水浴30 min后再次測定405 nm處吸光度值。GBA酶活性=〔(OA 30 min－OA 0 min)/(OA標準液－OA 水)〕×250(U/L)。

1.2.4 細胞內(nèi)α－Syn寡聚體的檢測

依據(jù)參考文獻［12］所述原理，利用特殊的ELISA方法檢測α－Syn寡聚體。首先，用3D5小鼠抗人α－Syn單克隆抗體［13］(1 μg/mL)包被酶標板，4 ℃ 過夜。然后用2%牛血清白蛋白封閉，37℃孵育2 h，加入事先制備好的不同質(zhì)量濃度α－Syn寡聚體及待檢測樣品，100 μL/孔，于37℃孵育2 h。加入生物素化3D5抗體稀釋至1 μg/mL，37℃孵育2 h。加入堿性磷酸酶標記的親和素抗體(1/20 000)，37℃孵育1 h。以上每次反應結(jié)束后用PBST洗4次，每次5 min。最后加入對硝基酚磷酸顯色液(pNpp)，37℃孵育30 min。測定405 nm處吸光度值。

1.2.5 細胞自噬活性的測試

提前20 min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。按說明配制洗滌液(1×assay buffer)和檢測工作液(每1 mL 完全培養(yǎng)基加 2 μL Cyto－ID○R和 1 μL Hoechst 33342 Nuclear Stain)。操作步驟按照 Cyto－ID○R自噬檢測試劑盒說明書進行。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.6 細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的測試

將DHE溶解于DMSO，配制成適當質(zhì)量濃度的母液，將其直接添加至細胞培養(yǎng)基中，濃度為10 μmol/L，37℃避光孵育30 min進行熒光探針裝載，隨后用PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下(放大200倍)觀察結(jié)果。每孔隨機取3個無重疊視野拍照，觀察熒光強度。試驗重復3次。

1.2.7 凋亡細胞的檢測

應用AO/PI染色法檢測凋亡細胞。細胞用96孔板培養(yǎng)。實驗結(jié)束后，吸棄各孔培養(yǎng)基，用PBS洗凈細胞，加入50 μL AO染料，37℃溫孵10 min后，再加入50 μL PI染料，繼續(xù)溫孵10 min。每次反應結(jié)束后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下(放大200倍)觀察結(jié)果。每孔隨機取至少3個無重疊視野拍照計數(shù)。試驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(ˉx±SE)表示，細胞內(nèi)活性氧含量的測試以及凋亡細胞的檢測使用析因方差分析法進行假設檢驗，其余數(shù)據(jù)使用單因素方差(ANOVA)分析法進行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制GBA活性對細胞內(nèi)α-Syn寡聚體形成的影響

首先測試了不同質(zhì)量濃度(12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L)的 GBA 活性抑制劑——CβE 對 GBA活性的影響。用CβE處理MES23.5細胞48 h后測定GBA活性。結(jié)果顯示，GBA活性隨著CβE質(zhì)量濃度的增加而下降(圖1)。在另一組細胞，觀察了CβE對α－Syn寡聚體形成的影響。細胞首先用不同濃度的CβE處理48 h后，然后將 α－Syn單體(1 μmol/L)添加到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h使其進入細胞。然后提取細胞總蛋白，利用ELISA方法檢測α－Syn寡聚體的含量。結(jié)果顯示，12.5 μmol/L的 CβE可以引起細胞內(nèi)的α－Syn寡聚體顯著增加，隨著 CβE濃度的加大，α－Syn寡聚體的含量也進一步增多(圖2)。

圖1 CβE抑制細胞GBA活性Fig.1 CβE Inhibits GBA activity

2.2 抑制GBA活性對細胞自噬活性的影響

圖2 抑制GBA活性增加細胞內(nèi)α-Syn寡聚體含量Fig.2 Inhibition of GBA activity increases the amount of α-Syn oligomers in cells

將細胞分為兩組，一組用CβE(100μmol/L)處理48 h后細胞外添加不同濃度(0、1、10 μmol/L)的 α－Syn單體，另一組不用CβE處理，僅在細胞外添加不同質(zhì)量濃度α－Syn單體。48 h后測定自噬活性。在無 α－Syn 處理細胞，未見自噬活性改變，1 μmol/L α－Syn引起個別細胞出現(xiàn)自噬體，而增加α－Syn至10 μmol/L可以使自噬體數(shù)量有所增加。CβE本身可以誘導自噬體的出現(xiàn)，在存在α－Syn的情況下，其誘導的自噬體的數(shù)量進一步增多。與沒有CβE處理的細胞相比較，CβE處理細胞的自噬體的數(shù)量明顯增多(圖3)。

2.3 抑制GBA活性對細胞氧化應激和凋亡的影響

細胞分組和處理方法同上。細胞內(nèi)氧化應激水平通過使用DHE活性氧探針檢測(圖4)。結(jié)果顯示，在無CβE處理組細胞，隨著添加的α－Syn量的增多，氧化應激水平增高，但只有當α－Syn濃度達到10 μmol/L時，氧化應激水平變化才具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在CβE處理細胞，氧化應激水平也隨著α－Syn濃度加大而逐漸加大，但其變化幅度明顯大于無CβE處理細胞，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

AO/PI染色結(jié)果顯示，在不做任何處理的正常細胞，所有細胞被染成綠色，沒有紅染的細胞出現(xiàn)，提示沒有產(chǎn)生凋亡細胞。在單純α－Syn(1 μmol/L和)處理細胞，雖然大多數(shù)呈綠色，但可見部分細胞被染成紅色，紅染的細胞在10 μmol/L α－Syn處理組明顯多于1 μmol/L處理組。在單純CβE處理組也未見明顯的呈紅染的凋亡細胞，而在CβE和α－Syn雙重處理的細胞，紅染的凋亡細胞明顯增多，其數(shù)量在10 μmol/L α－Syn處理組明顯多于1 μmol/L處理組(圖5)。

圖3 抑制GBA活性對細胞巨自噬活性的影響Fig.3 Effect of GBA activity inhibition on macroautophagic activity

圖4 抑制GBA活性對細胞內(nèi)氧化應激水平的影響Fig.4 Effect of GBA activity inhibition on ROS levels

3 討論

本研究利用培養(yǎng)MES23.5多巴胺神經(jīng)細胞研究了抑制GBA活性對細胞內(nèi)α－Syn寡聚體形成的影響。鑒于MES23.5多巴胺神經(jīng)細胞是由小鼠神經(jīng)母細胞瘤和大鼠中腦多巴胺神經(jīng)細胞雜交而成，表達極少量的鼠源性α－Syn，筆者將重組人α－Syn加入到培養(yǎng)基，利用該蛋白能夠迅速以被動擴散方式進入細胞并不被蛋白降解系統(tǒng)分解的特性，使其進入細胞［14］。與基因轉(zhuǎn)染方法相比較，這種方法可以控制細胞內(nèi)α－Syn的含量，有助于觀察在細胞內(nèi)α－Syn含量不同的情況下，抑制GBA活性對α－Syn寡聚體形成的影響。利用這個細胞模型，筆者首先觀察了GBA活性抑制劑CβE對α－Syn寡聚體形成的影響。結(jié)果表明，CβE引起濃度依賴的GBA活性下降和細胞內(nèi)的α－Syn寡聚體增多。這一結(jié)果提示，GBA活性下降是細胞內(nèi)α－Syn寡聚體增多的原因。

圖5 抑制GBA活性對細胞凋亡率的影響Fig.5 Effect of GBA activity inhibition on apoptotic rates

已知，細胞內(nèi)的自噬系統(tǒng)包括微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和伴侶分子介導的自噬(CMA)［15］。正常情況下，α－Syn 通過伴侶分子介導的自噬(CMA)降解。抑制GBA活性將削弱伴侶分子介導的自噬(CMA)介導的α－Syn降解，并導致α－Syn寡聚體增加，而聚集的α－Syn寡聚體不能有效地通過伴侶分子介導的自噬(CMA)降解［16］。然而，巨自噬在清除細胞內(nèi)的 α－Syn寡聚體中發(fā)揮重要作用［17］。因此，筆者進一步觀察了在GBA活性被抑制的情況下，自噬活性的變化。筆者用100 μmol/L CβE抑制GBA活性。這一濃度的CβE可以使GBA活性下降60%，與GBA突變引起的PD患者黑質(zhì)GBA活性的下降程度相當［18］。筆者發(fā)現(xiàn)，在單純用α－Syn處理細胞時，細胞內(nèi)幾乎不出現(xiàn)自噬體，而在GBA活性被抑制的情況下用α－Syn處理細胞時，則很多細胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體，并且自噬體的數(shù)量隨α－Syn濃度的增加而增加。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因很可能是正常情況下α－Syn在進入細胞后能夠迅速而有效地被CMA或泛素－蛋白酶體途徑降解，而在GBA活性受抑制時，由于細胞內(nèi)α－Syn寡聚體含量的增加激活了細胞的巨自噬系統(tǒng)。α－Syn寡聚體含量增加激活巨自噬的機制之一很可能是其引起細胞內(nèi)的活性氧增加。以往的研究表明，α－Syn寡聚體可以增加細胞內(nèi)的活性氧，后者被證明對巨自噬具有刺激作用。作為這一推測的證據(jù)，筆者發(fā)現(xiàn)在用α－Syn和CβE同時處理細胞時細胞內(nèi)的活性氧增加。

盡管巨噬活性的代償性增強有助于α－Syn寡聚體的清除，但過度的巨噬活性增強也將對細胞產(chǎn)生破壞作用，引起自噬性細胞死亡(autophagic cell death)。因此，導致α－Syn和CβE處理細胞凋亡的機制之一很可能與過度的巨自噬活性增強有關。本研究結(jié)果對揭示自噬功能改變引起PD神經(jīng)退變的機制具有重要意義。

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