肖艷紅，李 菁，劉祝祥，杜 次，李 貴

(吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000)

蛇足石杉(Huperzia serrata(Thumbs.)Trev.)為我國傳統(tǒng)中草藥，屬石杉科(Huperiaceae)石杉屬(Huperzia Bernh.)的蕨類植物。民間常用于治療癰癤腫毒、跌打損傷等癥。從蛇足石杉中分離得到的石杉?jí)A甲(Huperzine A)，是一種選擇性強(qiáng)、高效、可逆的乙酰膽堿酯酶抑制劑，對(duì)于預(yù)防和治療老年性癡呆具有顯著療效且毒副作用?。?］。然而，石杉類植物作為古老的蕨類植物類群，存在著生境特化、植株矮小、居群偏小、自然更新速度慢和生長周期較長等諸多不利因素。通過其他途徑獲得石杉?jí)A無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。目前，石杉?jí)A甲的臨床用藥都直接或間接地源于蛇足石杉的自然資源，這導(dǎo)致了蛇足石杉野生資源破壞嚴(yán)重而日趨枯竭。鐵載體(siderophores)是一類具有很強(qiáng)的特異螯合Fe3+(螯合系數(shù)可達(dá)1020～1030)的小分子(1 ～2 ku)化合物［2］，它的產(chǎn)生是地球上微生物適應(yīng)地球地殼高氧低鐵環(huán)境的結(jié)果［3］。細(xì)菌利用合成的鐵載體攫取外界游離Fe3+來維持正常的生理活動(dòng)。同時(shí)，細(xì)菌在環(huán)境中的生存地位也可以通過其對(duì)環(huán)境中鐵源的爭奪能力而反映出來［4］。因此對(duì)自然條件下產(chǎn)鐵載體菌的研究能夠解決許多因細(xì)菌引起的植物病害問題。若能從土壤中分離、篩選出產(chǎn)鐵載體的拮抗菌，再將其應(yīng)用到田間，在作物根際對(duì)鐵進(jìn)行生物富集，從而提高土壤中鐵的生物有效性，這將大大地促進(jìn)作物的生長［4-5］。由于產(chǎn)生鐵載體的細(xì)菌與不能產(chǎn)生鐵載體的或產(chǎn)生鐵載體少的有病害的微生物競爭鐵元素，從而抑制有害微生物的生長繁殖，改善整個(gè)作物的生態(tài)環(huán)境，為保護(hù)作物免受病原菌的侵害起到一定的作用［4-6］。迄今，有關(guān)蛇足石杉鐵載體細(xì)菌方面的研究尚未見報(bào)道。本文以蛇足石杉根際土壤為研究對(duì)象，對(duì)蛇足石杉根際土壤微生物進(jìn)行分離、篩選，獲得1株產(chǎn)鐵載體細(xì)菌，并對(duì)該菌進(jìn)行了初步鑒定，為蛇足石杉根際促生菌的開發(fā)利用提供優(yōu)良的菌種來源，同時(shí)為解決蛇足石杉快速繁殖及生長發(fā)育問題提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蛇足石杉根際土樣采集與處理 供試材料蛇足石杉根際土樣采自湖南省古丈縣高望界林場(海拔 570 m，N28°38'27.7″，E110°02'02.1″)，采用五點(diǎn)法取樣。采樣時(shí)選取健康、長勢(shì)較為旺盛的植株，去除表層土壤和雜物。采集其根際土樣時(shí)將蛇足石杉整個(gè)植株連根挖出，去除根系上附著的大土粒，用無菌的毛刷將根上粘著的細(xì)土掃落到無菌袋后封口，貼上標(biāo)簽，然后將土樣用冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行根際土壤細(xì)菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基及鐵載體檢測液 ①細(xì)菌分離純化培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)［7］:牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 5.0 g，瓊脂 18 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0 ～7.2;②鐵載體檢測 CAS 染液:CAS(鉻天青)1 mmol/L，F(xiàn)eCl30.1 mmol/L，十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)［8］4 mol/L;0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8):每100 mL含Na2HPO4· 12H2O 2.427 g，NaH2PO4·2H2O 0.5905 g;KH2PO40.075 g，NH4Cl 0.250 g，Na-ClO 0.125 g，使用時(shí)稀釋 10 倍［9］;③鐵載體檢測CAS檢測平板配制:每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL，10% 酸水解酪素 3 mL，1 mmol/L CaCl2100 μL，1 mmol/L MgSO42 mL，瓊脂 1.8 g［9］。

1.1.3 儀器、設(shè)備及試劑 生化培養(yǎng)箱BMJ100(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，高壓蒸汽滅菌鍋MJ-54A(美國STIK)，單人水平垂直兩用凈化工作臺(tái)CJ-1F(蘇州華宏凈化技術(shù)有限公司)，高速臺(tái)式離心機(jī) Centrifuge 5810R(德國 Eppendorf)，PCR儀ABI 2720型(美國ABI)，凝膠成像系統(tǒng)Tanon-2500(上海天能科技有限公司)，所用分子生物學(xué)試劑均購自上海生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛇足石杉根際細(xì)菌分離與純化 稱取1 g根際土樣加入到裝有99 mL無菌生理鹽水的250 mL三角瓶中，120 r/min振蕩30 min，得到菌懸液，梯度稀釋至10－7g/mL。采用涂布平板法，取0.2 mL稀釋后不同濃度梯度的菌懸液分別涂布到分離培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋梯度設(shè)3次重復(fù)，將涂布好的平板至37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后開始觀察，同時(shí)記錄分離平板上菌株的菌落特征，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色和大小等特征挑取不同的單菌落，在分離純化培養(yǎng)基上用四分體劃線法經(jīng)連續(xù)4代劃線純化，得到細(xì)菌純培養(yǎng)物。

1.2.2 蛇足石杉根際細(xì)菌產(chǎn)鐵載體細(xì)菌的初篩

將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種到CAS檢測平板上，37℃培養(yǎng)48 h，經(jīng)過培養(yǎng)的CAS檢測平板上，分泌鐵載體的細(xì)菌菌落周圍會(huì)出現(xiàn)明顯的橙黃色暈圈，并可通過暈圈直徑大小來初步判斷菌株產(chǎn)鐵載體能力的強(qiáng)弱。

1.2.3 蛇足石杉根際細(xì)菌產(chǎn)鐵載體細(xì)菌的復(fù)篩

挑取暈圈比較明顯的菌落，接種于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，然后將菌懸液8000 r/min離心15 min后，得到細(xì)菌發(fā)酵上清液。分別取發(fā)酵上清液與CAS檢測液各3 mL，充分混勻。1 h后采用721型分光光度計(jì)在630 nm波長處測定吸光值(As)，并取雙蒸水作對(duì)照調(diào)零。另取3 mL CAS檢測液與3 mL未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上清液充分混勻，同上測定吸光值即為參比值(Ar)。按照文獻(xiàn)［10］對(duì)鐵載體活性單位的定義，根據(jù)公式計(jì)算菌株產(chǎn)鐵載體的量:

1.2.4 細(xì)菌菌落形態(tài)、革蘭染色與顯微形態(tài)觀察

挑取純化后的單菌落，四分體劃線接種到牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察并拍照，然后挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色和顯微形態(tài)觀察。

1.2.5 細(xì)菌基因組DNA提取和16S rDNA基因的擴(kuò)增 酶解法提取菌體中的基因組DNA:取50 mg菌體加1×TE稀釋成2 mg/mL的溶菌酶500 μL放入37℃搖床1～2 h，加入50 μL 20%SDS和5 μL濃度為20 μg/mL蛋白酶 K混勻1 min，置55℃烘箱保溫60 min。結(jié)束后加入550 μL苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻抽提，12000 r/min離心10 min，取上清液。上清液加入800 μL 無水乙醇、80 μL 3mol/L 乙酸鈉(pH 4.8～5.2)室溫放置 15 min。12000 r/min 離心10 min，除上清液，加入200 μL 70%乙醇洗鹽1～2次，12000 r/min低溫離心5 min，棄乙醇。55℃干燥后加入1×TE 50 μL溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆?。采用?xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增的通用引物(正向引物:5'-CCGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGC-3';反向引物:5'-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3')，以細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;30個(gè)循環(huán):94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s;72℃延伸10 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.6 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行部分測序，測序結(jié)果利用BLAST軟件(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在GenBank、EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，選取同源性最高的且有效發(fā)表的菌株序列作為參比對(duì)象，用CLUSTAL W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算測試菌株和參比菌株之間的序列相似性，采用 Neighbor-Joining法，利用 MEGA5軟件(http://www.Megasoftware.net)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［11］，自展數(shù)(bootstrap)為 1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛇足石杉根際鐵載體細(xì)菌的分離與篩選

用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離蛇足石杉根際細(xì)菌，依據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小及革蘭染色結(jié)果，挑選100株不同細(xì)菌。將100株細(xì)菌培養(yǎng)于CAS檢測平板上，經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，得到1株產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)的菌，命名為JSX 389。其周圍出現(xiàn)橙黃色的暈圈(圖1C)，表明該菌株具有產(chǎn)鐵載體的能力。為了鑒定該菌株產(chǎn)鐵載體能力，按1.2.3中的方法對(duì)該菌產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行定量檢測;在波長630 nm 處As的光吸收值為0.167，而 Ar為0.341，可算得 As/Ar=0.490，(Ar－As)/Ar=51.02%，說明該菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)鐵載體能力［8，12］。

2.2 細(xì)菌菌落形態(tài)、革蘭染色與顯微形態(tài)觀察結(jié)果

按照2.1方法對(duì)菌株 JXS 389進(jìn)行菌落形態(tài)、革蘭染色與顯微形態(tài)觀察，結(jié)果如圖1A、B所示。從圖1中可以看出菌株JXS 389菌落為乳白色、濕潤光滑微向上突起菌落;革蘭染色后，顯微觀察菌體呈紫色，細(xì)桿狀，表明該菌為革蘭陽性桿菌。

圖1 產(chǎn)鐵載體菌形態(tài)特征及CAS檢測篩選Fig.1 The morphology and screening of siderophore producing property by CAS detecting plates of strain JX S389

2.3 JSX 389的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)可產(chǎn)鐵載體細(xì)菌JSX 389的16S rDNA全基因進(jìn)行測序，得到總長為1515 bp的16S rDNA序列，并將測序結(jié)果提交GenBank，序列接收號(hào)為KC192729。根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的JSX 389的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。從JSX 389系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株JSX 389與Lysinibacillus屬菌株聚類在一個(gè)大枝上，JSX 389應(yīng)屬于Lysinibacillus屬;JSX 389和有效發(fā)表菌株Lysinibacillus sinduriensis BLB-1 KCTC 13296T和Lysinibacillus massiliensis 4400831T以較高的自展值(99)聚在一個(gè)小枝上，且JSX 389與Lysinibacillus sinduriensis BLB-1 KCTC 13296T的序列相似性為98%，與Lysinibacillus massiliensis 4400831T的序列相似性為96.5%，按照16S rDNA序列相似程度小于97%可歸于不同物種標(biāo)準(zhǔn)［13-14］，菌株JSX 389可能與Lysinibacillus sinduriensis BLB-1 KCTC 13296T屬同一物種。但是 Lysinibacillus sinduriensis BLB-1 KCTC 13296T分離自海洋，而JSX 389分離自蛇足石杉根際土壤，且能產(chǎn)生鐵載體，具體分類地位還有待進(jìn)一步研究。

圖2 菌株JSX 389的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of strain JSX 389

3 結(jié)論與討論

本研究從蛇足石杉根際土樣中分離了1株具產(chǎn)鐵載體能力的細(xì)菌JSX 389，并對(duì)其菌落形態(tài)特征、革蘭染色和顯微形態(tài)特征進(jìn)行觀察，顯示JSX 389為革蘭陽性的桿菌。JSX 389的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明:JSX 389應(yīng)為Lysinibacillus屬菌株，因JSX 389和有效發(fā)表菌株Lysinibacillus massiliensis 4400831T聚在一個(gè)小枝上，且JSX 389與Lysinibacillus sinduriensis BLB-1 KCTC 13296T的序列相似性為98%，JSX 389可能與Lysinibacillus sinduriensis BLB-1 KCTC 13296T屬同一物種，但后者分離自海洋，JSX 389分離自蛇足石杉根際土壤，且能產(chǎn)生鐵載體，具體分類地位還有待研究。產(chǎn)鐵載體細(xì)菌在環(huán)境中能夠迅速穩(wěn)定地分泌鐵載體，這不僅可以實(shí)現(xiàn)可利用鐵源的自足，還能為植物根際周圍小生境提供過量的鐵載體，為其他利用同源鐵載體植物的生長提供便利，同時(shí)它也可與植物病原微生物爭奪有限的鐵營養(yǎng)，從而抑制病原微生物的生長［15］。JSX 389為蛇足石杉根際細(xì)菌，產(chǎn)生鐵載體的能力較強(qiáng)，能否像其他植物根際鐵載體細(xì)菌具有促生長作用，促進(jìn)蛇足石杉的生長，還有待進(jìn)一步深入研究。

［1］魯翠濤，梅興國，鐘凡.千層塔生物學(xué)特性的初步研究［J］.中國野生植物資源，2002，21(4):33-35.

［2］Shelly MP.Detection，isolation and characterization of siderophores［J］.Methods in Enzymology，1994，235:329-344.

［3］David AH，Amy EW，Alison B，et al.Competition among marine phytoplankton for deferent chelated iron species［J］.Letters to Nature，1999，400(6747):858-861.

［4］于柏峰，張慧云，劉冰，等.銅綠假單胞菌致病力和致病機(jī)理研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2004，24(1):52-53.

［5］劉健，李俊，葛誠.微生物肥料作用機(jī)理的研究新進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2001，21(1):33 －36，46.

［6］余賢美，鄭服叢.嗜鐵素在促進(jìn)植物生長及病害防治等方面的應(yīng)用［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23(8):507-510.

［7］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:高等教育出版社，1999:69.

［8］王平，董飚，李阜棣，等.小麥根圈細(xì)菌鐵載體的檢測［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1994，21(6):323-326.

［9］趙翔，謝志翔，陳紹興，等.適合高鐵載體細(xì)菌篩選、檢測體系的改進(jìn)與探析［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(6):13-18.

［10］Machuca A，Milagres AMF.Use of CAS-Agar plate modified to study the effect of different variables on the siderophore production by Aspergillus［J］.Letters in Applied Microbiology，2003，36(3):177-181.

［11］Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5:Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood，Evolutionary Distance，and Maximum Parsimony Methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28(10):2731-2739.

［12］孫磊，邵紅，劉琳，等.可產(chǎn)生鐵載體的春蘭根內(nèi)生細(xì)菌多樣性［J］.微生物學(xué)報(bào)，2011，51(2):189-195.

［13］肖懷東，陳義光，劉祝祥，等.湛江硇洲島?？嚓P(guān)可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2009，49(2):246-250.

［14］Stackebrandt E，Goebel BM.Taxonomic note:a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1994，44(4):846-849.

［15］趙翔，陳紹興，謝志雄，等.高產(chǎn)鐵載體熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens sp-f的篩選鑒定及其鐵載體特性研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2006，46(5):691-695.