蔡 珺，陳 新，鄭 恒

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430030)

左炔諾孕酮為合成的強(qiáng)效孕激素，是消旋炔諾孕酮的光學(xué)活性體，活性比炔諾孕酮強(qiáng)1倍，約為炔諾酮的100倍。是目前應(yīng)用較廣泛的一種口服避孕藥。藥物口服吸收迅速而完全?？诜笾饕植?肝、腎、卵巢及子宮。本藥在肝內(nèi)代謝，多以葡萄糖醛酸鹽及硫酸鹽形式從尿液和糞便中排出［1］。

由于左炔諾孕酮血藥濃度低，且極易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，因此濃度測(cè)定比較困難。本試驗(yàn)旨在建立液相－串聯(lián)質(zhì)譜方法測(cè)定人血漿中左炔諾孕酮的濃度，適用于左炔諾孕酮的血藥濃度監(jiān)測(cè)和人體藥代動(dòng)力學(xué)的研究，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

左炔諾孕酮片 (規(guī)格:1.5 mg/片，批號(hào):100508);左炔諾孕酮標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):100076200703);內(nèi)標(biāo):甲基睪丸酮對(duì)照品(湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究所提供);乙腈(美國(guó)天地公司)，色譜純;甲醇(美國(guó)天地公司)，色譜純;乙醚(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分析純;甲酸(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，分析純;試驗(yàn)用水:Milli－Q超純水。

高效液相色譜儀器:安捷倫1200液相色譜儀，含G1322A在線脫氣機(jī)、G1311A高壓四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱;質(zhì)譜儀器:API 4000 LC/MS/MS System，配備電噴霧離子化源(ESI)，美國(guó) ABI公司;色譜工作站:Analyst 1.5;Adventurer電子分析天平;TL80－2醫(yī)用離心機(jī)(江堰市天力醫(yī)療器械有限公司);TGL－16G臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);WH－1微型旋渦混和儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 受試者選擇

選擇健康女性受試者20名，年齡范圍為21—28歲，體質(zhì)量指數(shù)為19—24 kg·m－2。無(wú)既往病史和藥物過敏史，無(wú)煙酒嗜好，試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用任何藥物，3個(gè)月未參加其他藥物試驗(yàn)。試驗(yàn)前接受全面體檢，結(jié)果均正常。受試者于試驗(yàn)前簽署知情同意書。

1.3 給藥方案及血樣采集

本試驗(yàn)方案由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

受試者于試驗(yàn)前1周和試驗(yàn)期內(nèi)禁飲各種飲料，禁煙酒，并在試驗(yàn)開始前一天進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)病房，晚上進(jìn)統(tǒng)一清淡飲食后開始禁食。于次日早晨空腹分別口服左炔諾孕酮片1.5 mg，用200 mL溫開水送服;服藥2 h后方可飲水，4小時(shí)后進(jìn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐(低脂肪飲食)。受試者服藥后應(yīng)避免劇烈運(yùn)動(dòng)，亦不得長(zhǎng)時(shí)間臥床。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在醫(yī)生和護(hù)士的監(jiān)護(hù)下進(jìn)行。

于服藥前(0 h)及服藥后0.25 h，0.5 h，0.75 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，3.0 h，5.0 h，9.0 h，14.0 h，24.0 h，36.0 h，48.0 h 和 72.0 h，采集肘靜脈血約 4 mL于肝素抗凝試管中，離心分離血漿(3000轉(zhuǎn)/分，10 min)，血樣置于－80℃保存待測(cè)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱:Ultimate C18(5 μm，2.1 ×150 mm);預(yù)柱:C18 保護(hù)柱(4 ×3.0 mm I.D.，美國(guó)Phenomenex公司);流動(dòng)相:甲醇∶乙腈∶0.1%甲酸水溶液(80∶8∶12，V/V);流速:0.3 mL·min－1;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:35 ℃。

質(zhì)譜條件:離子檢測(cè)方式:選擇性離子檢測(cè)(MRM);離子極性:正離子;離子化方式:氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI);檢測(cè)對(duì)象:左炔諾孕酮，m/z 313.10—245.20;甲基睪丸酮，m/z 303.20—97.10;源電壓(IS):5500V;源溫度(TEM):550℃;碰撞氣(CAD):4.0ps;氣簾氣(CUR):27psi;霧化氣(GASl):40psi;加熱輔助氣(GAS2):60psi。

1.4.2 試驗(yàn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)品貯備液:精密稱取左炔諾孕酮適量，以Milli－Q超純水為溶劑溶解，定量配制成左炔諾孕酮濃度為 2.375 mg·mL－1，11.85 mg·mL－1，23.75 mg·mL－1，47.5 mg·mL－1，129.0 mg·mL－1，152.0 mg·mL－1，237.5 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，以及濃度為0.655 mg·mL－1，9.5 mg·mL－1，19.0 mg·mL－1的質(zhì)控溶液，置于4℃保存，臨用時(shí)取出。

內(nèi)標(biāo)貯備液:精密稱取甲基睪丸酮適量，以Milli－Q超純水為溶劑溶解，按分子量換算后，定量配制成甲基睪丸酮濃度為123.6 mg·mL－1的溶液，作為內(nèi)標(biāo)貯備液，置于4℃保存，臨用時(shí)取出。

1.4.3 血漿樣品處理

精密吸取血漿1000 μL于10 mL玻璃離心管中，精密加入Milli－Q超純水100 mL，加入內(nèi)標(biāo)液100 μL(123.6 μg/L)，混勻，渦混30 s，加入4 mL 乙醚，渦混3 min，于4 000 r·min－1離心5 min，取全部上層有機(jī)溶劑至10 mL玻璃管，40℃氮?dú)饬鞔蹈?，殘留物用流?dòng)相溶液200 μL復(fù)溶，渦混30 s后轉(zhuǎn)入 1.5 mLEP 管中，于 12 000 r·min－1離心 5 min，取上清液150 μL至自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣5 μL，進(jìn)行LC－MS/MS測(cè)定，記錄色譜圖及待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿，精密加入不同濃度的左炔諾孕酮標(biāo)準(zhǔn)溶液受適量，配制成相當(dāng)于左炔諾孕酮血藥濃度為 0.237 5 mg·mL－1，1.185 mg·mL－1，2.375 mg·mL－1，4.75 mg·mL－1，12.9 mg·mL－1，15.2 mg·mL－1，23.75 mg·mL－1的樣品，按“1.4.3 血漿樣品處理”同樣操作。以待測(cè)物血藥濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值f為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.4.5 精密度、準(zhǔn)確度與回收率

精密吸取空白血漿1 000 μL，精密加入左炔諾孕酮質(zhì)控溶液100 μL，配制成相當(dāng)于左炔諾孕酮血藥濃度為0.655 mg·mL－1，9.5 mg·mL－1，19.0 mg·mL－1的低、中、高質(zhì)控樣品，按“1.4.3 血漿樣品處理”同樣操作，并進(jìn)行含量測(cè)定。每個(gè)濃度5份樣品，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算左炔諾孕酮的日內(nèi)精密度、日間精密度與準(zhǔn)確度。

將血漿與乙醚1∶4比例混合，渦混3 min，于4 000 r·min－1離心 5 min，取上清液，加入左炔諾孕酮質(zhì)控溶液和內(nèi)標(biāo)液各100 μL，配制成濃度為0.655 mg·mL－1，9.5 mg·mL－1，19.0 mg·mL－1的血漿樣品對(duì)照品，每個(gè)濃度樣品3份;精密吸取空白血漿1 000 μL，按“1.4.3 血漿樣品處理”同樣操作，配制成相當(dāng)于左炔諾孕酮低、中、高質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)濃度樣品5份。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行分析，比較2組峰面積，計(jì)算提取回收率。

1.4.6 穩(wěn)定性

按“1.4.5精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)”項(xiàng)下的方法操作，配制4份含低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品。1份樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置12 h，1份樣品在室溫放置12 h，1份樣品反復(fù)凍融3次，1份樣品－80℃冰凍30 d狀態(tài)下的穩(wěn)定性，對(duì)每份樣品分析測(cè)試，考察血漿中左炔諾孕酮的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 專屬性

在本試驗(yàn)條件下，同時(shí)測(cè)定空白血漿、空白血漿+左炔諾孕酮標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)對(duì)照溶液的血漿樣品及受試者給藥2.0 h后的血漿樣品，特征色譜圖見圖1。由圖可見，藥物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.49 min和2.70 min，峰形良好，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

結(jié)果表明本分析方法下左炔諾孕酮血藥濃度在0.237 5—23.75 mg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為 y=0.120x+0.00657(r=0.9971，n=6)，血漿中左炔諾孕酮的定量下限為0.237 5 mg·mL－1，RSD 值為 4.70%。

2.1.3 精密度、準(zhǔn)確度與回收率

測(cè)定結(jié)果表明，血漿樣品分析的精密度及準(zhǔn)確度良好，低、中、高質(zhì)控樣品日內(nèi)、日間RSD均小于3%，準(zhǔn)確度在97%—105%。左炔諾孕酮的絕對(duì)提取回收率在79%—85%。結(jié)果見表1。

表1 左炔諾孕酮的精密度、準(zhǔn)確度和回收率/%

2.1.4 穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，所有穩(wěn)定性考察樣品實(shí)測(cè)濃度和加入濃度相比，濃度變化范圍均在90%—110%之間，

圖1 血漿中左炔諾孕酮和內(nèi)標(biāo)的MRN色譜圖RSD＜5%，表明在本試驗(yàn)所考察的條件下，左炔諾孕酮的穩(wěn)定性均良好。

2.2 藥—時(shí)曲線

20名受試者單劑量口服左炔諾孕酮片后的平均藥—時(shí)曲線見圖2。

圖2 20名受試者單次口服左炔諾孕酮片后的平均血藥濃度—時(shí)間曲線

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

用梯形法計(jì)算AUC，以半對(duì)數(shù)作圖法由消除相濃度點(diǎn)計(jì)算t1/2;Tmax和Cmax用實(shí)測(cè)值，結(jié)果見表2。

表2 20名受試者口服左炔諾孕酮片的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

左炔諾孕酮主要作用于下丘腦和垂體，使月經(jīng)中期卵泡刺激素和黃體生成激素水平的高峰明顯降低或消失，顯著抑制排卵，有明顯的抗雌激素活性，比炔諾酮強(qiáng)10倍左右，幾乎不具有雌激素活性。本藥對(duì)子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化顯示極強(qiáng)的孕激素活性，可使子宮內(nèi)膜變薄，內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈低柱形，分泌功能不良，阻止孕卵著床。而且能使宮頸粘液變稠，阻礙精子穿透。從而起到避孕的作用［1］。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的報(bào)道［2－7］，測(cè)定左炔諾孕酮血藥濃度的方法有氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法、發(fā)射免疫法等，但這些測(cè)定方法樣品處理過程復(fù)雜，且靈敏度低，不能很好的滿足左炔諾孕酮的藥代動(dòng)力學(xué)等的研究要求。

本試驗(yàn)在液相條件優(yōu)化的過程中，通過大量比較試驗(yàn)，最終選定甲基睪丸酮作為內(nèi)標(biāo)。甲基睪丸酮在該試驗(yàn)分析條件穩(wěn)定性和靈敏度均最好、出峰時(shí)間與左炔諾孕酮相近，峰形好且不干擾藥物的測(cè)定。在提取劑的篩選過程中，對(duì)比了乙酸乙酯、正己烷、乙醚等不同的提取溶劑劑，結(jié)果顯示，以乙醚作為提取劑，血漿背景峰最少，回收率最高，由于乙醚極易揮發(fā)，縮短了樣品處理的周期。在流動(dòng)相的摸索過程中，經(jīng)過對(duì)比不同比例的甲醇、乙腈、水、甲酸水等混合溶劑體系和不同流速，結(jié)果表明，以甲醇∶乙腈∶0.1%甲酸水溶液(80∶8∶12，V/V)為流動(dòng)相，流速為 0.3 mL·min－1時(shí)，靈敏度和峰形均最佳。

在本試驗(yàn)分析測(cè)定方法下，左炔諾孕酮在血漿里的檢測(cè)限達(dá)到0.237 5 mg·mL－1，能更好的滿足左炔諾孕酮的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性的研究要求。

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