胡 海，張紅菱，陳 新，楊 桃，萬育紅

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

密蒙花又稱蒙花、羊耳朵、蟲見死草等，為馬錢科醉魚草屬植物Buddleja off cinalis Maxim.的干燥花蕾及花序［1］。《中國植物志》記載其分布于陜西、甘肅、西南、中南等地。山坡、雜木林地、河邊和丘陵常見?；ü┧幱?，可清肝明目，退翳，止咳［2］。主要用于目赤腫痛，多淚羞明，眼生翳膜，肝虛目暗，視物昏花。麥角甾苷(Acteoside)是密蒙花的主要活性成分之一［3－4］。具有抗衰老，抗病毒，抗菌，免疫抑制，抗癌，抗炎等藥理作用［5］。本文以本實(shí)驗(yàn)室分離、純化所得的麥角甾苷(純度為95%以上)為對照品，進(jìn)行密蒙花麥角甾苷含量測定和分析檢測方法研究［6－7］，在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)進(jìn)行密蒙花麥角甾苷的分離工藝研究。

馬繼平［8］等研究表明，錐形柱比相同體積、相同長度的圓柱形柱有更高的分離柱效和更大的樣品容量。本文采用錐形柱對密蒙花麥角甾苷進(jìn)行分離，通過考察分離柱角度，硅膠用量，洗脫流速等影響密蒙花麥角甾苷分離效率的因素，確定最優(yōu)分離工藝，為密蒙花麥角甾苷工業(yè)化快速分離提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

DIONEX高效液相色譜儀(備有單元泵、自動進(jìn)樣器以及UVD170U檢測器):美國戴安公司;SB－5200雙頻超聲清洗機(jī):寧波新芝生物科技有限公司;BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;瑞士 BUCHI公司;予華SHZ—D(1Q)循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器廠。

1.2 試驗(yàn)材料

麥角甾苷對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，乙睛(色譜純，科密歐公司)，試驗(yàn)用水為Aquapro超純水，其他試劑為分析純。密蒙花購于安徽亳州中藥材批發(fā)市場。5°砂芯層析柱(入口徑30mm出口徑10mm長度25cm)，15°砂芯層析柱(入口徑45mm出口徑15mm長度25cm)，45°砂芯層析柱(入口徑65 mm 出口徑10 mm 長度25 cm)，90°砂芯層析柱(內(nèi)徑25 mm長度25 cm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 密蒙花麥角甾苷樣品制備

將密蒙花在溫度60℃的條件下用60%乙醇溶液回流提取，密蒙花與乙醇溶液體積比為1∶10，共提取3次，每次提取時間2 h，合并提取液，濃縮得到粗提浸膏。粗提浸膏過層析柱得到試驗(yàn)用麥角甾苷樣品。實(shí)驗(yàn)時，取一定量麥角甾苷樣品過層析柱。

1.3.2 麥角甾苷測定方法

取麥角甾苷樣品/標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容至10 mL的容量瓶中，HPLC法測定麥角甾苷的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算麥角甾苷純度。

麥角甾苷樣品回收率(%)=C×稀釋倍數(shù)×V/m;式中:C為樣品中麥角甾苷質(zhì)量濃度(mg/mL);稀釋倍數(shù)為50;V為原液體積50 mL;m為樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 HPLC 檢測條件的選擇

GRACE C18(250×4.6 mm)色譜柱，流動相為乙睛∶水∶甲酸(18∶81∶1)，紫外檢測波長為334 nm，柱溫30℃，流速為1mL/min，檢測時間為 30 min［7］。

2.1.2 麥角甾苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和線性關(guān)系考察

精確稱取麥角甾苷對照品7.5 mg，用60%乙醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次取 5 mL，2.5 mL，1.25 mL，0.625 mL，0.313 mL 的對照品溶液用甲醇定容至10 mL 的容量瓶中，配制成 150 μg/mL，75 μg/mL，37.5 μg/mL，18.75 μg/mL，9.375 μg/mL 對照品溶液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.323 4 X－3.169 7。在9.375 μg/mL—150 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 麥角甾苷樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分離柱角度對分離效果的影響

將洗脫流速控制在18 ml/min，硅膠∶樣品的質(zhì)量比為 75∶1，在此實(shí)驗(yàn)條件下，分別選用5°，15°，45°，90°層析柱，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測得其平均純度為88%，回收率見圖2。

圖2 層析柱角度對麥角甾苷回收率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，選用15°層析柱分離時麥角甾苷回收率較高，選用5°，45°，90°層析柱麥角甾苷回收率相對較低。

2.2.2 硅膠用量對分離效果的影響

將洗脫流速控制在18 ml/min，選用15°層析柱分離，在此實(shí)驗(yàn)條件下，分別以硅膠∶樣品的質(zhì)量比為40∶1，50∶1，75∶1，100∶1，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測得其平均純度為88%，回收率見圖3。

圖3 硅膠與樣品的質(zhì)量比對麥角甾苷回收率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，硅膠∶樣品的質(zhì)量比為40∶1，50∶1，75∶1時麥角甾苷回收率隨著硅膠:樣品的質(zhì)量比的增大而增大，硅膠∶樣品的質(zhì)量比為75∶1時麥角甾苷回收率達(dá)到最大.但硅膠∶樣品的質(zhì)量比為100∶1時，麥角甾苷回收率減小，分析原因可能是硅膠過量導(dǎo)致分離過程樣品的死吸附量增大。

2.2.3 洗脫流速對分離效果的影響

將硅膠∶樣品的質(zhì)量比控制為75∶1，選用15°層析柱分離。在此實(shí)驗(yàn)條件下，分別一流速為12 mL/min，18 mL/min，24 mL/min，30 mL/min 條件下洗脫，測得其平均純度為88%，回收率見圖4。

圖4 洗脫流速/對麥角甾苷回收率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洗脫流速為30 mL/min，24 mL/min，18 mL/min，時麥角甾苷回收率與洗脫流速成負(fù)相關(guān)。洗脫流速為18 mL/min時麥角甾苷回收率最大。隨著洗脫速度的增大，回收率降低，可能原因是流速過快導(dǎo)致洗脫劑與樣品不能充分接觸洗脫。

2.3 麥角甾苷分離最佳條件的確定

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選定層析柱類型，硅膠用量，洗脫流速三因素為考察指標(biāo)，按L9(34)正交表三因素三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，從中篩選最佳的分離條件見表1，結(jié)果見表2。如表2所示，正交試驗(yàn)結(jié)果表明分離柱角度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著，其次為硅膠用量。影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性因素依次為分離柱角度(A)＞硅膠用量(B)＞洗脫流速(C)。優(yōu)化后的分離工藝為A2B3C1。即選用15°層析柱，硅膠∶樣品的質(zhì)量比為75∶1，洗脫流速為18 mL/min。在此條件下，麥角甾苷回收率最大。為驗(yàn)證理論預(yù)測值，在最優(yōu)條件A2B3C1下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測得平均回收率為85.9%。說明優(yōu)化的方案可行。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試臉結(jié)果及分析

2.4 錐型柱分離與圓柱形柱分離的比較

在硅膠∶樣品的質(zhì)量比為75∶1，洗脫流速為18 mL/min的實(shí)驗(yàn)條件下，用圓柱形柱分離一定量的麥角甾苷樣品，測得回收率只有79.8%，而選用15°層析柱分離時麥角甾苷回收率可達(dá)86.0%，效果顯著提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，錐形柱分離效果明顯優(yōu)于圓柱形柱。

3 結(jié)論

由于錐型柱入口處橫截面積較大，可以使樣品平鋪均勻，且分離等量樣品時，與常規(guī)柱形相比，由于橫截面積大，樣品上樣厚度減小，相對柱高而言，其分離的理論踏板數(shù)增大。此外，錐型柱為橫截面直徑逐漸減小的錐形結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可以相對避免分離柱出口陡然減小時造成流路死角，從而減小柱外效應(yīng)［8］。選用錐形柱分離密蒙花麥角甾苷，柱效明顯高于圓柱型柱。

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對密蒙花麥角甾苷的分離影響最大的因素是分離柱的柱型，其次是硅膠用量。優(yōu)化后的密蒙花麥角甾苷錐形柱分離條件為15°層析柱，硅膠∶樣品的質(zhì)量比為75∶1，洗脫流速為18 mL/min。此條件下密蒙花麥角甾苷回收率達(dá)到85.9%。麥角甾苷的純度可達(dá)85%以上。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(二部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:230.

［2］中國科學(xué)院植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1992:277.

［3］韓澎，崔亞君，郭洪祝，果德安.密蒙花化學(xué)成分及其活性研究［J］.中草藥.2004，35(10):1086－1090.

［4］LI Jiao－she，ZHAO Yu－ying，MA Li－bin.A new phenylethanoid glucoside from Buddleia Officinalis Maxim ［J］. J Chin pharm Sci，1997，6(4):178.

［5］崔穎，張永旺.密蒙花研究進(jìn)展［J］甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2010，27(2):65 －68.

［6］戴樹培，曾嘉明，李教社，等.密蒙花有效成分提取及含量測定方法［J］.西北藥學(xué)雜志.1996，11(5):204 －205.

［7］韓澎，崔亞君，郭洪祝，等.中藥密蒙花藥材RP－HPLC指紋圖譜研究［J］.中國中藥雜志.2004，29(10):938 －940.

［8］馬繼平，陳令新，朱道乾，等.篩板對臺錐形制備液相色譜柱流型和柱效的影響［J］.色譜.2003，21(4):430 －433.