陳江山，胡 臣，馮陳龍，李 佳

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

蓮藕(Nelumba nucifera)系睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬(Nelumbo)多年生大型水生草本植物，在我國(guó)分布及栽培極為廣泛，以湖北、江蘇、安徽等省種植面積最大，是我國(guó)重要的水生蔬菜之一。蓮藕營(yíng)養(yǎng)豐富，含淀粉、蛋白質(zhì)、鈣、鐵及多種維生素等，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外其果實(shí)、種子、花、葉、地下莖各部分均為重要的傳統(tǒng)中藥材［1］。目前，我國(guó)蓮藕栽培大多采用種藕繁殖，其繁殖系數(shù)較低(1∶10)［2-3］，且容易積累病菌，影響生長(zhǎng)，甚至品種退化［4］。而采用組織培養(yǎng)技術(shù)［5-6］可有效除菌，提高蓮藕的繁殖系數(shù)。本文通過(guò)對(duì)蓮藕頂芽及側(cè)芽外植體的直接誘導(dǎo)方式獲得了不定芽［7］，為大規(guī)?？焖俜敝成徟褐仓昙斑M(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蓮藕品種為鄂蓮五號(hào)“3735”［8］，由湖北省武漢市東西湖區(qū)吳家山西湖大隊(duì)提供。于3—4月間栽種期，取藕頭飽滿、頂芽完整的種藕為試材。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

選取頂芽與側(cè)芽，將其外部葉片剝?nèi)ィ谧詠?lái)水下沖洗干凈，然后在無(wú)菌條件下用75%的酒精消毒30 s，隨即放入0.1%升汞溶液中處理15 min，用無(wú)菌水漂洗4次，縱切成0.3—0.5 cm3的外植體，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的 6-BA、NAA、IBA，pH 調(diào)至5.8—6.0，蔗糖3%，添加不同濃度的瓊脂粉或Gelrite，以及不同濃度的活性炭，組成各種培養(yǎng)基［9］(見(jiàn)表1)。

(2)分化培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的 6-BA、NAA，pH 調(diào)至 5.8—6.0，蔗糖3%，添加0.2%Gelrite，組成各種培養(yǎng)基(見(jiàn)表2)。

表1 蓮藕不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.3 培養(yǎng)條件

溫度為25±2℃，每天照光16 h，光照強(qiáng)度為1 000—2 000 Lux的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配比對(duì)蓮藕不定芽誘導(dǎo)的影響

將蓮藕的頂芽和側(cè)芽縱切成0.3—0.5 cm3的外植體，按照表1所示的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，接種在不同濃度配比的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中初代培養(yǎng)，10 d左右可見(jiàn)不定芽萌發(fā)，但萌發(fā)結(jié)果差異較大。40 d后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)表明不同外源激素濃度對(duì)蓮藕莖尖不定芽的誘導(dǎo)有較大的影響。

2.1.1 不定芽誘導(dǎo)率結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)正交分析顯示，比較極差(R值)大小，對(duì)誘導(dǎo)率的影響力由大到小為6-BA＞固化劑＞NAA＞IBA＞活性炭。由此可以看出，6-BA的濃度水平的變化對(duì)蓮藕不定芽的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，其影響極差(R值)可達(dá)58.325，比較K值，其作用效果為K1最小，K4最大，因此隨著6-BA的濃度增加，誘導(dǎo)率也明顯增加。其次為固化劑的影響，其作用效果值從大到小為K3＞K4＞K2＞K1，可見(jiàn)添加Gelrite比添加瓊脂粉，對(duì)不定芽的誘導(dǎo)更有利，然而并不是濃度越高效果越好，其最佳濃度為0.2%。NAA的添加也對(duì)不定芽的誘導(dǎo)起到明顯的作用，其R值為14.975，而K2值最大，說(shuō)明添加低濃度的NAA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)更為有利。IBA和活性炭對(duì)誘導(dǎo)率的影響不大，其極差分別為10和6.7。

綜合考慮各種因素的影響，從誘導(dǎo)率的結(jié)果看，實(shí)驗(yàn)12和14的效果最好，均達(dá)到93.3%，其次為實(shí)驗(yàn)13，結(jié)果為86.7%。

2.1.2 不定芽誘導(dǎo)數(shù)目情況分析

表1的正交分析結(jié)果顯示，對(duì)不定芽的誘導(dǎo)平均數(shù)影響的極值，從大到小為:6-BA＞NAA＞固化劑＞活性炭＞IBA。6-BA濃度大小的影響仍然最為顯著，R值為 1.077，而 K值顯示，K3最大，為1.89，說(shuō)明1.0 mg/L6-BA 對(duì)不定芽數(shù)的誘導(dǎo)效果最佳。其次，NAA的添加也對(duì)不定芽的平均個(gè)數(shù)有較大的影響，其作用效果為K3最大。此外，固化劑的使用也影響不定芽的數(shù)目，從K值可以看出，添加Gelrite比添加瓊脂粉更能促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)數(shù)目。同樣，IBA和活性炭的添加對(duì)平均個(gè)數(shù)影響不大。

不定芽誘導(dǎo)平均數(shù)最高的實(shí)驗(yàn)組為11號(hào)，可達(dá)2.75，而實(shí)驗(yàn)7、12、16 號(hào)均達(dá)到2 以上。

綜合對(duì)誘導(dǎo)率和不定芽平均數(shù)的分析結(jié)果，初步認(rèn)為是否添加IBA和活性炭對(duì)蓮藕不定芽的誘導(dǎo)影響不大，考慮可以在今后的實(shí)驗(yàn)中去除。

2.1.3 不定芽狀態(tài)分析

誘導(dǎo)出的不定芽的狀態(tài)情況見(jiàn)表1所示。

當(dāng)6-BA濃度較低，0或0.5 mg/L時(shí)，外植體易出現(xiàn)愈傷組織，其結(jié)構(gòu)疏松。而當(dāng)6-BA濃度較高，達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，外植體普遍出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀硬塊，結(jié)構(gòu)致密，不易分化成苗，此外，我們還實(shí)驗(yàn)了2.0 mg/L的濃度，同樣出現(xiàn)這種現(xiàn)象，且情況更為嚴(yán)重。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，不定芽較為粗壯，顏色嫩綠，狀態(tài)較好。

NAA對(duì)不定芽狀態(tài)的影響同樣較為顯著，當(dāng)其與6-BA的相對(duì)濃度較高時(shí)，外植體易出現(xiàn)愈傷組織，因此，選擇較為合適濃度的NAA對(duì)于不定芽的狀態(tài)調(diào)整極為重要。

固化劑的選擇也影響著不定芽的狀態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用瓊脂粉作為固化劑時(shí)，外植體易褐化，誘導(dǎo)形成的不定芽往往呈現(xiàn)暗綠色，不易成活，而使用Gelrite后，則情況有所改觀，不定芽普遍呈現(xiàn)嫩綠色，易于成活。若同時(shí)使用活性炭，則效果更佳。

2.2 不同培養(yǎng)基配比對(duì)蓮藕不定芽分化的影響

將誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽進(jìn)行切分，并接種入分化培養(yǎng)基中，25 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，如表2所示。

表2 蓮藕不定芽分化培養(yǎng)結(jié)果

結(jié)果表明，6-BA對(duì)不定芽分化的存活率以及生長(zhǎng)情況相較于NAA均有較大影響，其R值分別為74.966 和 0.576，而 NAA 的分別為 11.100 和0.153。隨著6-BA濃度的增加，存活率明顯提高，然而當(dāng)濃度較高時(shí)(2.0 mg/L)，不定芽粗壯而伴有硬塊，色暗綠。而當(dāng)NAA濃度升高時(shí)，則常伴有少量愈傷組織發(fā)生，從而影響不定芽的生長(zhǎng)。因此基于不定芽分化的結(jié)果分析，初步認(rèn)為最佳的激素配比應(yīng)為:1.0 mg/L的 6-BA 加 0.05 mg/L的NAA。

3 討論

在蓮藕不定芽的誘導(dǎo)和分化過(guò)程中，6-BA的作用效果比NAA更為顯著，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞分裂素對(duì)蓮藕芽的生長(zhǎng)起決定作用。然而，隨著其濃度的升高，培養(yǎng)組織易產(chǎn)生結(jié)節(jié)狀硬塊，因此，選擇適當(dāng)?shù)臐舛仁堑玫礁哔|(zhì)量芽的關(guān)鍵。

莖尖培養(yǎng)的最大特點(diǎn)是可獲得脫病毒苗。據(jù)李良俊等［10］研究認(rèn)為，對(duì)蓮藕不同生長(zhǎng)時(shí)間取材進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，取材于萌發(fā)時(shí)期的蓮藕外植體，轉(zhuǎn)綠和分化百分率均為最高，而取材于休眠期的外植體的轉(zhuǎn)化率最低僅為8.8%，而且轉(zhuǎn)綠的外植體幾乎不能進(jìn)一步分化。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取材于萌發(fā)時(shí)期的野生蓮藕外植體。切取不同大小的莖尖培養(yǎng)時(shí)，所獲取無(wú)菌苗的比率與莖尖的大小成反比，愈接近莖尖的頂端，帶病原菌的可能性就越少，所以我們采用的材料為較小的莖尖頂端。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，在蓮藕的組織培養(yǎng)過(guò)程中，其外植體極易褐化，尤其在初代培養(yǎng)時(shí)，原因可能與蓮藕中多酚氧化酶(PPO)的活性有關(guān)［11-12］。PPO在有氧氣的情況下可催化多酚類物質(zhì)［13］氧化成醌，醌再聚合成有色物質(zhì)，導(dǎo)致蓮藕褐化［14］。因此，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采取了多種方法抑制蓮藕外植體的褐化。首先，在切取外植體后應(yīng)迅速接種，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中;其次，我們?cè)诔醮囵B(yǎng)時(shí)，加入適量的活性炭，可吸附部分醌類;我們還發(fā)現(xiàn)使用Gelrite代替瓊脂作為固化劑可明顯抑制褐化的產(chǎn)生，可能是由于Gelrite成分單純，雜質(zhì)少，滲透性強(qiáng)，使產(chǎn)生的醌更快擴(kuò)散開(kāi)的緣故;若褐化較為嚴(yán)重，我們也嘗試采用抗壞血酸溶液浸泡外植體，可明顯改善褐化現(xiàn)象。一般來(lái)說(shuō)，初代培養(yǎng)比繼代培養(yǎng)褐化比例高，只要度過(guò)初代培養(yǎng)，后期可不必采取抑制褐化措施，只要注意及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基即可。

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