崔淑華，陳慰雙，錢家亮，段 浩，劉同英，張立東

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，山東 青島 266002；2.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；3.臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 臨沂 276034）

蔬菜和水果是人類平衡膳食的重要組成部分，近年來各國膳食指南都強(qiáng)調(diào)增加蔬菜和水果的攝入種類和數(shù)量，因此蔬菜和水果的質(zhì)量安全非常重要。近年來，由于不正確、不合理使用農(nóng)藥，導(dǎo)致污染蔬菜和水果，引起農(nóng)藥中毒的事件不斷發(fā)生。各國政府為保障國民健康和保護(hù)國內(nèi)貿(mào)易，對(duì)果蔬中幾百種農(nóng)藥制定了嚴(yán)格的最高殘留限量要求。因此發(fā)展快速、可靠、靈敏和實(shí)用的多種類農(nóng)藥殘留分析技術(shù)是控制其殘留、保證食品安全和避免國際間有關(guān)貿(mào)易爭端的基礎(chǔ)。

近幾年，隨著分析儀器的研發(fā)和應(yīng)用，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）、液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-TOF MS）及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS／MS）等高靈敏度、高選擇性儀器不斷應(yīng)用于果蔬中農(nóng)藥多殘留分析［1-9］，但這些儀器價(jià)格比較昂貴，對(duì)操作人員素質(zhì)的要求較高，因此，使用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）進(jìn)行蔬菜和水果中農(nóng)藥多殘留分析仍是最常用的檢測(cè)技術(shù)。在農(nóng)藥殘留分析中，樣品前處理技術(shù)具有十分重要的作用，直接決定了分析結(jié)果的精確性。固相萃取（SPE）技術(shù)因具有通用性強(qiáng)、凈化效果好和操作簡單等優(yōu)勢(shì)而成為目前國內(nèi)外農(nóng)藥多殘留分析中最常用的樣品前處理技術(shù)。目前國內(nèi)外對(duì)蔬菜和水果中農(nóng)藥多種類殘留的檢測(cè)報(bào)道很多，采用的固相萃取柱主要有PSA［10，11］、NH2［5，12］、C18［13］、CARB／NH2［3，4，14-17］、SAX／PSA［18］、CARB／PSA 柱［19-21］等。但這些檢測(cè)方法對(duì)固相萃取吸附劑凈化機(jī)理的研究很少，對(duì)不同類型吸附劑凈化效果的比較也不多。本文在初步明確PSA、C18和CARB凈化機(jī)理的基礎(chǔ)上，通過系統(tǒng)優(yōu)化SPE柱填料、洗脫溶劑和洗脫體積，建立了凈化效果好、操作簡便、選擇性好和靈敏度高的蔬菜和水果中193種農(nóng)藥的多殘留分析方法，在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中取得了滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890A氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電子轟擊源（EI）和7683型自動(dòng)進(jìn)樣器（美國Agilent公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；5810R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；T25型均質(zhì)器（德國IKA公司）；TurboVap LV型樣品自動(dòng)濃縮儀（美國Caliper公司）；MS 3基本型旋渦混合器（德國IKA公司）。

乙腈、正己烷（色譜純，德國 Merck公司）；丙酮、甲苯（色譜純，美國TEDIA試劑公司）；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用前在450℃下烘5h，冷卻至200℃時(shí)取出、冷卻，備用）；SAX／PSA固相萃取柱（6mL，500mg／500 mg，美國VARIAN公司）；C18／PSA固相萃取柱（6 mL，500mg／500mg）、CARB固相萃取柱（6mL，500mg）、NH2固相萃取柱（6mL，500mg）均購自天津博納艾杰爾科技有限公司。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度不低于95%，均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:根據(jù)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，準(zhǔn)確稱取適量農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用丙酮／正己烷（3／7，v／v）配成1000mg／L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液的配制:193種農(nóng)藥根據(jù)化合物保留時(shí)間分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，分別移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用上述丙酮／正己烷配成10mg／LⅠ、Ⅱ、Ⅲ組的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。內(nèi)標(biāo)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取適量磷酸三苯酯（TPP），用上述丙酮／正己烷配成300mg／L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用上述丙酮／正己烷配成3mg／L內(nèi)標(biāo)溶液。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:先分別將10 mg／LⅠ、Ⅱ、Ⅲ組混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋配成5、2、1、0.5、0.2、0.1mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液是在樣品空白基質(zhì)提取凈化殘?jiān)?，加?50μL上述丙酮／正己烷溶劑、50μL內(nèi)標(biāo)溶液和100μL上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻后配成10、20、50、100、200、500、1000μg／L基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。該溶液臨用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

提取:稱取10g樣品（精確至0.01g）置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20mL乙腈溶液，均質(zhì)提取1min，然后加入3g無水硫酸鎂和2g氯化鈉，于5000r／min下離心5min，取10mL上層提取液至雞心瓶中，于40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL。

凈化:用4mL乙腈預(yù)洗C18／PSA固相萃取柱，當(dāng)液面到達(dá)吸附劑的頂部時(shí)，將上述提取溶液轉(zhuǎn)入柱中，用2mL乙腈洗滌樣液瓶，將洗滌液移入SPE柱中，再用1mL乙腈重復(fù)洗瓶并將其轉(zhuǎn)入SPE柱中。待溶液達(dá)到吸附劑頂部時(shí)，加入2mL乙腈至該柱進(jìn)行洗脫，收集所有流出物，氮?dú)獯蹈伞６考尤?0μL 3mg／L內(nèi)標(biāo)溶液、950μL丙酮／正己烷（3／7，v／v）溶劑，渦旋混勻后，用于 GC-MS測(cè)定。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱:HP-5ms石英毛細(xì)管柱，30m×0.25 mm×0.25μm；色譜柱升溫程序:初溫70℃，保留1 min，以25℃／min升至150℃，再以3℃／min升至200℃，最后以8℃／min升至280℃，保留5min；載氣:氦氣，純度≥99.999%；恒壓模式，壓力為137.9kPa；進(jìn)樣口溫度:250℃，脈沖不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量:2μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

EI源，碰撞能量:70eV；離子源溫度:230℃；四極桿溫度:150℃；GC-MS接口溫度:280℃；采集方式:SIM；溶劑延遲:5.0min。每種化合物分別選擇1個(gè)定量離子、2～3個(gè)定性離子，每組所有需要檢測(cè)的離子按照出峰順序，分時(shí)段分別檢測(cè)。每種化合物通過GC-MS檢測(cè)的保留時(shí)間、定量離子及定性離子等質(zhì)譜條件見表1。

表1 193種農(nóng)藥的保留時(shí)間、特征離子、線性相關(guān)系數(shù)、定量限、檢出限、回收率范圍及精密度（n＝6）Table 1 Retention times，characteristic ions，correlation coefficients，LOQs，LODs，recovery ranges and RSD（n＝6）ranges of the 193 pesticides

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品凈化方法的選擇

2.1.1 SPE填料的選擇

本研究對(duì)菠菜提取液經(jīng)PSA、CARB和C18固相萃取柱凈化、乙腈洗脫的凈化液進(jìn)行全掃描分析，全掃描圖譜分別見圖1～圖3。對(duì)凈化后的干擾物進(jìn)行NIST譜庫檢索發(fā)現(xiàn)，PSA凈化后的干擾物主要為維生素E、豆甾醇和植物醇等多種甾醇類化合物，C18凈化后的干擾物主要為亞油酸、亞麻酸和棕櫚酸等多種脂肪酸，而使用CARB凈化后僅有少量的軟脂酸和硬脂酸干擾物?？梢?，3種凈化劑對(duì)不同基質(zhì)干擾物的吸附性能差別較大。PSA主要對(duì)脂肪酸類化合物產(chǎn)生吸附，C18主要吸附樣品基質(zhì)中的甾醇、維生素等干擾物，CARB對(duì)甾醇、維生素和色素等雜質(zhì)的吸附效果都很好。但CARB對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的化合物（如噻菌靈、蠅毒磷和嘧菌環(huán)胺等）吸附很強(qiáng)，單獨(dú)使用乙腈對(duì)多農(nóng)藥進(jìn)行洗脫時(shí)，很多農(nóng)藥都不能被洗脫下來，必須加入甲苯進(jìn)行洗脫，而甲苯的加入會(huì)破壞CARB對(duì)多種雜質(zhì)的吸附效果，使最終凈化效果變差?？紤]到C18與CARB吸附的干擾物類型相似，但C18具有對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥都不產(chǎn)生吸附，不需用甲苯這種高毒性溶劑洗脫等優(yōu)點(diǎn)，本研究選擇C18和PSA作為SPE填料。

圖1 菠菜提取液經(jīng)PSA固相萃取柱凈化后的總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of spinach extract purged by an SPE column filled with PSA

圖2 菠菜提取液經(jīng)C18固相萃取柱凈化后的總離子流圖Fig.2 TIC chromatogram of spinach extract purged by an SPE column filled with C18

圖3 菠菜提取液經(jīng)CARB固相萃取柱凈化后的總離子流圖Fig.3 TIC chromatogram of spinach extract purged by an SPE column filled with CARB

2.1.2 SPE填料串聯(lián)模式的確定

將Ⅰ組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加于C18和PSA固相萃取柱上進(jìn)行梯度洗脫試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):用C18柱凈化時(shí)，1mL乙腈對(duì)農(nóng)藥的洗脫率大多處于70%～80%之間，2mL乙腈可將大多數(shù)農(nóng)藥全部洗脫；而使用PSA柱凈化時(shí)，除少數(shù)農(nóng)藥外，使用1mL乙腈即可將大多數(shù)農(nóng)藥全部洗脫。因此，SPE柱填裝時(shí)，采用C18在上，PSA在下，即C18／PSA串聯(lián)方式。

2.1.3 洗脫溶劑的選擇和洗脫體積的確定

將Ⅰ組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加于C18／PSA柱上，分別用不同體積的乙腈和丙酮／正己烷（3／7，v／v）進(jìn)行洗脫，以明確其洗脫回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):使用乙腈洗脫時(shí)，3mL乙腈可使大多數(shù)農(nóng)藥的洗脫回收率達(dá)95%以上，但對(duì)速滅磷、異丙威和氧化樂果需4mL以上乙腈才能使其洗脫回收率達(dá)90%以上；使用丙酮／正己烷洗脫時(shí)，2mL即可使大多數(shù)農(nóng)藥的洗脫回收率達(dá)到90%以上，但對(duì)三唑類農(nóng)藥（如粉唑醇、烯唑醇、氟苯嘧啶醇）和菊酯類農(nóng)藥（如氟丙菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯）需4mL洗脫溶劑才使其被全部洗脫?？梢?，使用這兩種洗脫溶劑進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫用量均應(yīng)大于4mL。由于提取時(shí)使用100mL雞心瓶對(duì)提取液進(jìn)行濃縮，因此需要使用一定量的溶劑洗滌雞心瓶。本實(shí)驗(yàn)確定先使用2mL和1 mL洗脫液洗滌雞心瓶2次，將洗滌液傾入SPE柱中，待洗滌液達(dá)到SPE柱頂部時(shí)，再加入2mL洗脫液，共5mL洗脫液進(jìn)行SPE凈化洗脫。

取菠菜提取液過C18／PSA柱凈化，分別用5 mL乙腈和丙酮／正己烷（3／7，v／v）洗脫；同時(shí)將提取液使用GB／T 19648-2006“水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定:氣相色譜-質(zhì)譜法”的凈化方法（過CARB／NH2柱，用乙腈／甲苯（3／1，v／v）洗脫）進(jìn)行處理，凈化液濃縮后進(jìn)行全掃描分析，掃描圖譜見依次圖4～圖6?？梢?，用C18／PSA凈化、乙腈洗脫的凈化效果最好，各種基質(zhì)干擾物被較好地吸附在固相萃取柱中。因此，本研究選擇過C18／PSA固相萃取柱、5mL乙腈洗脫的凈化方式，與GB／T 19648-2006相比，操作簡便、使用較少量的溶劑取得了更佳的凈化效果。

圖4 菠菜提取液經(jīng)C18／PSA凈化、乙腈洗脫的總離子流圖Fig.4 TIC chromatogram of spinach extract cleaned-up with C18／PSA and eluted by acetonitrile

圖5 菠菜提取液經(jīng)C18／PSA凈化、丙酮／正己烷（3／7，v／v）洗脫的總離子流圖Fig.5 TIC chromatogram of spinach extract cleaned-up with C18／PSA and eluted by acetone／hexane（3／7，v／v）

2.2 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

將基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，以TPP為內(nèi)標(biāo)，以農(nóng)藥的質(zhì)量濃度對(duì)農(nóng)藥峰面積與TPP峰面積的比值進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，甲基對(duì)硫磷等34種農(nóng)藥在20～1000μg／L、乙氧羧草醚等26種農(nóng)藥在50～1000μg／L、葉菌唑等3種農(nóng)藥在100～1000μg／L，其余130種農(nóng)藥在10～1000μg／L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9967～1.0000。方法的檢出限（S／N＝3）為0.04～8.26μg／kg，定量限（S／N＝10）為0.13～27.03μg／kg。193種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限結(jié)果見表1。

圖6 菠菜提取液經(jīng)CARB／NH2 凈化、乙腈／甲苯（3／1，v／v）洗脫的總離子流圖Fig.6 TIC chromatogram of spinach extract cleaned-up with CARB／NH2and eluted by acetonitrile／toluene（3／1，v／v）

2.3 方法的回收率和精密度

在陰性菠菜、大蔥、草莓和蘋果樣品中添加20、40、100μg／kg的甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、多效唑、腈菌唑、環(huán)丙唑醇、烯唑醇、三唑磷、丙環(huán)唑、芐呋菊酯、氟苯嘧啶醇、氟丙菊酯、腈嘧菌酯、敵百蟲、硫線磷、炔戊菊酯、安果、三唑酮、己唑醇、丙溴磷、加普胺、溴蟲睛、戊唑醇、氯菊酯、甲胺磷、久效磷、磷胺、螺環(huán)菌胺、三唑醇、殺撲磷、p，p′-DDE、硫丹、氰戊菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，50、100、200μg／kg的氟菌唑、乙氧羧草醚、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、苯醚甲環(huán)唑、溴氰菊酯、乙酰甲胺磷、氟鈴脲、α-666、炔戊菊酯、唑螨酯、異狄氏劑、炔螨特、滅菌唑、氯丹混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，100、200 μg／kg的乙環(huán)唑和葉菌唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和10、20、100μg／kg的193種農(nóng)藥中其余農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置30min，待農(nóng)藥被樣品充分吸收后，按上述前處理方法進(jìn)行處理，做回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，計(jì)算精密度，結(jié)果見表1。由表1可見，193種農(nóng)藥平均加標(biāo)回收率為71.6%～117.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.0%～11.8%。

2.4 實(shí)際樣品分析

按照本方法對(duì)從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買的香蕉、蘋果、葡萄、草莓等20個(gè)水果樣品和菠菜、青椒、蒜薹、大蔥等50個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)樣品300多批，結(jié)果在3個(gè)樣品中檢出4種農(nóng)藥，分別為草莓中毒死蜱20.2μg／kg，氯氰菊酯102.8μg／kg，青椒中嘧霉胺110.6μg／kg，小松菜中甲霜靈88.2μg／kg。

3 結(jié)論

通過對(duì)樣品凈化步驟的優(yōu)化，本文建立了一種簡單、高效的測(cè)定蔬菜和水果中193種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。該方法用乙腈均質(zhì)提取殘留農(nóng)藥，C18／PSA固相萃取柱凈化，乙腈洗脫濃縮后進(jìn)行GC／MS分析。與其他多殘留分析方法相比，具有凈化效果好、溶劑使用少、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，在日常實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用取得了滿意的結(jié)果。

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